基因元素之间的相互作用对自然和人工表型至关重要，通常涉及复杂的编码和非编码序列组合。然而，在哺乳动物系统中，测试高阶遗传扰动面临限制。先前的CRISPR-Cas9筛选对每个细胞只能进行三种干扰，而Cas12a能够通过单个启动子生成多个CRISPR RNA，有望实现更大规模的干扰，但其DNase活性可能导致基因毒性。为了减轻这种影响，DNase失活的Cas融合蛋白（如dCas9的CRISPR干扰和CRISPR激活）已被广泛应用。利用DNase失活的Cas12a（dCas12a）进行多位点CRISPRi的研究平台将有助于组合基因功能的研究。尽管dCas12a在单个实验中展现了潜力，其在组合CRISPRi筛选中的效果尚不确定，需进一步研究。目前，dCas12a CRISPRi融合构建体在低剂量慢病毒递送时表现欠佳，限制了其在组合筛选中的应用。
为了解决这一问题，研究人员开发了一种带有R1226A突变的氨基酸球菌Cas12a（AsCas12a）变体。该突变增强了体外实验中核糖核蛋白-DNA复合物作为切口DNA中间体的稳定性。研究结果发表在《Nature Biotechnology》期刊上，题为Engineered CRISPR-Cas12a for Higher-Order Combinatorial Chromatin Perturbations。这一组合CRISPRi平台能够高效发现增强子元件，并探索顺式调控元件的高阶组合干扰，为有效导航染色质干扰的巨大组合空间奠定了框架。
一、通过慢病毒递送的dAsCas12a融合蛋白进行的CRISPRi缺乏活性
研究人员在这项研究中开发了一种基于AsCas12a的CRISPRi功能基因组学平台，这是目前唯一在哺乳动物细胞中进行组合筛选并证明有效的Cas12a同源物。之前的研究表明，通过质粒瞬时转染的方式在HEK 293T细胞中使用dAsCas12a进行CRISPRi是可行的。但是，在K562细胞中使用慢病毒递送的crRNA进行测试时，并未观察到基因表达的变化。为了提高CRISPRi活性，研究人员通过慢病毒转导等实验发现，与HEK 293T细胞中的质粒瞬时转染不同，dAsCas12a-3xKRAB和慢病毒crRNA构建体需要特定的条件才能实现最佳CRISPRi活性。在对Cas12a进行多种优化突变的探索后，研究人员确定了denAsCas12a-KRAB为最有效的变体，该变体在抑制CD55基因上表现出强烈的效果，但在CD81基因上的抑制效果却不一致。
研究还发现，提高denAsCas12a-KRAB的感染复数（MOI）可以改善CRISPRi的基因敲低效率。然而，在较低的MOI水平下，其活性下降甚至消失。为了解决这些不一致和缺陷，研究人员还探索了消除AsCas12a DNase活性的替代方法，例如使用截短的crRNA间隔区。然而，这些方法在不同细胞系中表现出较弱且不一致的CRISPRi活性。
图1 dAsCas12a-KRAB变体在慢病毒递送的crRNA中表现出弱且受剂量限制的CRISPRi活性
二、MultiAsCas12a-KRAB（R1226A/E174R/S542R/K548R）显著改善了通过慢病毒递送的CRISPRi
为验证在dAsCas12a中完全激活DNA切割功能会通过降低DNA亲和力来阻碍强CRISPRi活性，研究人员进行了体外研究，发现当非靶链预切割时，dCas12a-DNA复合物的稳定性提高了20倍。R1226A突变以显著降低其切割活性而闻名。通过引入这一突变，研究人员发现该变体比完全失活的D908A变体更有效地结合DNA。研究结果表明，R1226A突变可以延长染色质占据时间，并通过KRAB结构域增强转录抑制复合物的招募。在将multiAsCas12a（多重转录干扰AsCas12a）变体与denAsCas12a-KRAB进行对比的实验中，发现multiAsCas12a在各种构建体中展现了稳定且强大的CRISPRi活性，并且对低蛋白质和crRNA水平的敏感性较低，且几乎没有脱靶效应。这一改进不仅恢复了几个先前无效的crRNA构建体的效力，还保持了靶位点上的低插入缺失（indel）频率，表明其在有效基因敲低的同时，尽量减少了对基因表达的潜在干扰。
图2 MultiAsCas12a-KRAB（R1226A/E174R/S542R/K548R）通过促进切口DNA中间体，显著增强慢病毒递送的CRISPRi活性
三、MultiAsCas12a-KRAB通过高阶crRNA阵列慢病毒构建体实现多基因转录抑制
为了评估multiAsCas12a-KRAB在CRISPRi中的活性，研究人员利用慢病毒crRNA阵列进行了测试，以观察其在每个细胞中靶向三个或更多基因位点的效果。结果表明，multiAsCas12a-KRAB在各种构建体中表现出显著的CRISPRi活性，基因敲低效果强烈依赖于KRAB结构域。插入缺失（indel）分析显示，基因敲低主要是由于转录的非遗传扰动，而非DNA残余切割。在单细胞水平上，multiAsCas12a-KRAB比denAsCas12a-KRAB更有效，成功实现了多个靶点的敲低，尤其是在高阶构建体中，尽管部分构建体显示出活性下降。这些结果表明，multiAsCas12a-KRAB在多重CRISPRi应用中具有潜力，并强调了pre-crRNA序列背景对CRISPRi效率的不可预测影响。
图3 MultiAsCas12a-KRAB通过高阶crRNA慢病毒构建体实现多基因CRISPRi扰动
四、MultiAsCas12a-KRAB在组合单导向CRISPRi筛选中优于denAsCas12a-KRAB，并表现出与dCas9-KRAB类似的性能
研究人员设计了一个包含77,387个单一crRNA慢病毒构建体的文库，以根据细胞适应性评估Cas12a CRISPRi活性与转录起始位点（TSS）的关系。在表达multiAsCas12a-KRAB的K562细胞中进行的组合适应性筛选显示，细胞适应性评分的符合度高于denAsCas12a-KRAB，表明其性能更好且非特异性基因毒性较低。结果显示，multiAsCas12a-KRAB在TSS周围有效生成了CRISPRi活性的元基因谱，类似于dCas9-KRAB，并优于denAsCas12a-KRAB。尽管靶向非典型PAM的少数crRNAs表现出活性，但PAM序列内各个crRNA的活性差异显著，这些差异无法完全通过CRISPick模型预测。
图4 MultiAsCas12a-KRAB支持针对TSS的组合CRISPRi筛选，包含6重crRNA阵列
五、MultiAsCas12a-KRAB通过6重crRNA阵列实现组合CRISPRi筛选
为了探究multiAsCas12a-KRAB在组合CRISPRi筛选中的效率，研究人员开发了一个新的文库，并在K562细胞中利用表达multiAsCas12a-KRAB进行了筛选。该变体显示出了高度的重复一致性，并且没有观察到显著的非特异性基因毒性。实验结果揭示，相较于单独的crRNA，位点间隔区的细胞适应性缺陷较弱，而活性单crRNA的召回率介于59%至90%，这说明大多数单个活性crRNA在整合进6重阵列时仍维持了其活性。
图5 MultiAsCas12a-KRAB CRISPRi支持增强子扰动与发现
六、顺式调控元件的发现与高阶组合干扰
人类基因组预计有大约50万个增强子，但其中只有一小部分被功能测试过。这项研究证实了multiAsCas12a-KRAB能够通过CRISPRi技术干扰基因启动子及其增强子，特别展示了其靶向HBG1/HBG2旁系基因和HS2增强子的能力。在K562细胞的CD55基因座中，研究人员发现了若干之前未被表征的增强子，这些增强子调控CD55的表达，这在髓系细胞中是首次进行的功能验证。此外，研究人员还利用multiAsCas12a-KRAB研究了MYC基因座上高阶扰动的影响，发现同时靶向多个顺式调控元件比单独靶向启动子能产生更强的基因敲低效果。这些发现突出了multiAsCas12a-KRAB在增强子研究中的应用潜力，并显示了组合靶向调控元件可以有效调控基因表达，为高效测试遗传扰动提供了新的框架。
图6 multiAsCas12a-KRAB对顺式调控元件的高阶组合靶向建立了群体测试框架
总体上，CRISPR-Cas系统在染色质干扰研究中的应用正迅速发展。通过巧妙地结合不同的效应蛋白结构域，multiAsCas12a支持对多个染色质干扰目标进行群体测试。结合群体测试框架，multiAsCas12a能够促进组合遗传过程的设计与理解，这一规模是之前难以实现的，涵盖了广泛的生物学领域。本研究证明了multiAsCas12a-KRAB作为高阶组合CRISPRi干扰的强大平台，展现了其在基因转录调控和增强子功能研究中的优越性，使其成为精确基因调控的可靠工具。