肝脏，这个身体中至关重要的器官，其细胞生长的奥秘正逐渐被揭开。“类器官之父”Hans Clevers团队最新研究发现，人类胎儿和成人肝细胞类器官在生长过程中展现出截然不同的特征和要求。研究人员通过对人类肝细胞类器官的有丝分裂原和代谢敏感性进行详细分析，揭示了胎儿和成人肝细胞类器官在生长要求上的差异。这项研究为我们揭开了肝脏细胞生长背后的奥秘，为慢性肝病治疗和再生医学提供了新的思路。让我们一起探索这个引人入胜的领域，了解肝脏细胞生长的关键要求和机制。

当前，我们对肝细胞在发育与再生过程中的生长机制及其所需条件的理解尚显不足。以往的研究主要集中在啮齿类动物模型上，而对人类肝细胞生长和再生的具体机制了解仍较为有限。通过深入研究肝细胞类器官的生长过程，我们可以更清晰地揭示肝细胞生长的关键因素和条件，这对于优化治疗性再生策略，特别是针对慢性肝病的治疗，具有极其重要的意义。

  1. 从胎儿肝脏组织中建立了人类胎儿肝细胞（FH）类器官系列。

  2. 通过单细胞分析和基因表达变化的时间分析来进行实验策略。

  3. 探究IL6补充和FXR激活对类器官生长和脂质代谢的影响。

  4. 开发了一种成熟方案，以改善FH类器官的培养条件。

1. 人胎儿肝脏肝细胞类器官建立的时间分辨转录组特征

研究团队利用来自两个供体的胎儿肝脏组织，通过接种肝细胞悬浮液至肝细胞特异性扩增培养基上的基底膜提取物(BME)穹丘中，成功培育了胎儿肝细胞(FH)类器官。在播种后的短时间内，类器官开始形成并逐渐扩展。免疫荧光特性分析确认了这些类器官为胎儿肝细胞，并且它们表现出肝细胞特有的标志物，但缺乏胆管细胞标志物。通过单细胞RNA测序技术，发现FH类器官中细胞具有一致肝细胞身份，且具有活跃的糖/脂代谢和药物代谢基因表达。此外，通过mRNA测序和主成分分析(PCA)，研究人员观察到了类器官生长过程中显著的转录组变化，这些变化被划分为七个不同的基因簇，每个簇均显示出独特的时间动态，涉及能量需求、增殖反应、非肝细胞标记的消失、细胞因子信号、细胞质运输、未折叠蛋白反应以及脂质代谢等多个方面（图1）。

图1

2. 增殖和脂质代谢之间的逆转录组关系是肝细胞类器官生长的基础

组织簇2和7的基因表达趋势揭示了代谢和增殖之间的反向关系对类器官生长的重要性。通过对FH类器官系早期转录组反应的单细胞分析，观察到播种后24小时内存在显著的转录组变化，特别是细胞周期和DNA复制基因的上调以及代谢相关基因的下调。这种变化强调了Wnt信号在类器官生长中的重要性，并揭示了脂质稳态在多个水平上的复杂改变。此外，研究人员还评估了单细胞类器官生长过程中脂滴的存在，发现播种后短时间内细胞会积累脂滴，但随后在分裂过程中迅速消失。这些观察结果类似于啮齿动物部分肝切除后的短暂脂质表型和代谢增生性转录组重连接，但暂时脂肪变性的起源和相关性尚待进一步研究（图2）。

图2

3. 基于生长信息信号的人胎儿肝细胞类器官成熟

研究发现，虽然去除Wnt信号中的RSPO1对类器官生长无显著影响，但去除CHIR会导致类器官迅速死亡。在探索其他促进成熟的因素时，研究聚焦于HNF4α和CREB这两个在肝脏代谢调控中起核心作用的分子，并加入了福斯克林（FSK）和地塞米松（DEX）。结果显示，类器官的形态迅速转变为具有厚壁的结构，开始增殖，并至少能存活3周，且细胞表现出成熟肝细胞的典型特征，如多角形形态、体积增大、双核细胞增多等。进一步分析显示，成熟培养基中多种CYP和胆汁酸转运体SLC10A1 (NTCP)的表达增加。这些结果表明，通过转录组干扰生长相关信号可以有效地实现FH类器官的进一步成熟（图3）。

图3

4. 影响人胎儿肝细胞类器官生长的因素鉴定

通过转录组组织数据集，研究团队在类器官生长的早期阶段识别了假定的非肝细胞衍生因子，这些因子在多种肝细胞存在的情况下表现出了特定的基因表达特征。其中，基因簇5表现出短暂的炎症样反应，与白细胞介素（特别是IL-6）的显著表达相关。为了区分这些因子是肝细胞自主产生还是非肝细胞衍生，团队比较了两个转录组数据集的基因表达趋势，发现白细胞介素主要起源于非肝细胞，而EGF家族配体则可能是肝细胞自主产生的。进一步的功能性分析显示，FH类器官对多种细胞因子和生长因子敏感，其中NRG1、IL6和IL11显著促进了类器官的生长。此外，与多种肝脏疾病相关的il-1β也促进了FH类器官的生长（图4）。

图4

5. 人类成人肝细胞类器官的初始生长模仿胎儿的反应，但早期停滞

通过采用与FH类器官相同的实验方法和扩增培养基，利用两个不同年龄段的商业原代人肝细胞(PHH)进行评估，发现这些细胞在7天内能形成小的类器官，但随后生长停滞，并且传代后无法继续生长。通过转录组分析，发现两名PHH供者的转录组学趋势基本相似，表明肝细胞生长差异在出生后已迅速确定。进一步分析显示，成人肝细胞的早期反应类似于胎儿肝细胞，但随后在类器官传代后，逆增殖-脂质代谢转录组关系未能重启，导致转录组反应趋于平缓。此外，脂质代谢相关基因和衰老标记CDKN1A(p21)的表达变化进一步证实了生长停滞的现象（图5）。

图5

6. 通过重新平衡细胞代谢状态改善人类成人肝细胞类器官生长

通过测试多种生长因子，发现IL-6的补充显著促进了PHH的生长，但随后出现自发的脂质积累和细胞分裂减少。为逆转这种衰老现象，研究人员补充了FXR，发现同时补充IL6和FXRa（FXR激动剂）能显著促进PHH类器官的强劲生长和再生，同时避免脂质积累。进一步，我们利用BMP拮抗剂Noggin促进类器官的再生，并在两个年轻供体的PHH中实现了至少4个月的连续扩增。

对IL6+FXRa处理的PHH类器官进行表征，结果显示其呈现典型肝细胞形态，表达成熟肝细胞标志物，且未检测到未成熟或胆管细胞标志物。单细胞RNA测序揭示了肝细胞标志物的广泛表达，包括与细胞色素P450相关的基因，以及高凝固性群体的特征表达。此外，IL6靶基因和受FXR信号抑制的基因表达模式进一步验证了IL6+FXRa信号的活性。直接比较PHH类器官与胎儿肝细胞（FH）类器官的单细胞特征，揭示了它们在细胞组成和表达模式上的差异，这些差异反映了胎儿和成人肝细胞在类器官培养中的不同生长需求（图6、7）。

图6

图7

本研究通过对人类肝细胞器官的有丝分裂原和代谢敏感性进行图谱分析，揭示了胎儿和成人肝细胞类器官在生长要求上的差异。研究发现，人类胎儿肝细胞类器官和成人原代肝细胞器官在生长过程中存在明显的转录组差异，尤其是在有丝分裂和代谢方面。胎儿肝细胞类器官在生长初期表现出增加的增殖信号和抑制的代谢信号，而成人肝细胞类器官则在生长过程中迅速出现增殖和代谢失衡，导致脂肪变性和类器官生长停滞。这些发现为设计促进胎儿和成人肝细胞类器官生长的培养条件提供了重要线索，有望为慢性肝病的治疗和再生策略提供新的思路。

参考文献

Hendriks D, Artegiani B, Margaritis T, Zoutendijk I, Chuva de Sousa Lopes S, Clevers H. Mapping of mitogen and metabolic sensitivity in organoids defines requirements for human hepatocyte growth. Nat Commun. 2024 May 13;15(1):4034. doi: 10.1038/s41467-024-48550-4. PMID: 38740814; PMCID: PMC11091073.