之前一直从事工作是体外生物实验，当接触到体内实验比如PK&PD，难免心里总存在很多的疑问图片，你是否也这样呢？

今天要讲述的是：如何通过体外小分子药物活性（例如细胞实验或者酶活实验的IC50等）确定动物体内药效剂量？或者说如何将体外、体内两者联系起来。

为确保我们可以扎实的掌握此知识，将通过两个方面分享：

一、基础知识图片

    1.体外实验

    2.PPB血浆蛋白结合率

    3.PK

    4.PD

    5.PK-PD

二、实验动物给药剂量确定方法

1. 基础知识

1. 体外实验：

    体外试验主要用于筛选候选化合物，初步了解受试物的作用机制、敏感肿瘤类型和作用强度，为随后进行的体内试验提供参考。

    针对细胞毒类抗肿瘤药物的体外活性一般会通过生化或肿瘤细胞增殖实验检测受试物的靶向性、敏感肿瘤类型和作用强度，为随后进行的体内试验提供参考。以同一样品的不同浓度对酶活肿瘤细胞生长抑制率获得的结果得到剂量依赖曲线，计算半抑制浓度IC50，或80%抑制浓度IC80来获得药物体外活性。一般合成化物或植物提取纯品的IC50<10ug/mL，则判断药物在体外有抑制作用。

    计算公式：抑制率%=（1-OD实验/OD对照）x 100%

    • 一般情况下，只有游离型药物才能通过脂膜向组织扩散，被肾小管滤
      过或被肝脏代谢，因此药物与蛋白的结合会明显影响药物分布与消除的动
      力学过程，并降低药物在靶部位的作用强度。

    • 由于生化实验一般是化合物与酶直接反应，反应的是100%游离态化合物的活性。

    • 对于细胞类实验，细胞培养时一般需要加10%FBS（胎牛血清）所以在加药物处理后，一部分化合物会与培养基中的血清蛋白结合，另一部分未结合的游离化合物进入细胞与靶蛋白结合。因此得到的IC50值需要经过血浆蛋白结合率折算。但这个只是其中一种考量方法。

2. PPB(plasma protein binding)血浆蛋白结合

PPB实验测到的参数游离分数（fraction unbound，fu）,它对于预测药物相互作用（DDI），估计治疗指数（TI），开发PK/PD关系具有重要的作用. 而药物血浆蛋白结合与药物代谢动力学又有着复杂的计算关系。

  • 许多药物能够与血浆蛋白、组织蛋白、脂肪或体内大分子物质结合（如DNA、酶、粘多糖等反应）生成药物-蛋白复合物，不能透过血管进入组织发挥药效。

  • 血液中药物存在形式：游离型、血浆蛋白结合型；只有游离型药物才能从血液向组织转运，并在作用部位发挥药理作用.

  • 常见的结合蛋白：

      • 白蛋白(albumin)：占血浆蛋白总量的60%；可结合大多数酸性药物和一些碱性药物

      • α1酸性糖蛋白(alpha acid glycoprotein)

      • 脂蛋白（lipoprotein）：主要与碱性和中性药物结合

  • 药物与蛋白质的结合：

      • 氢键和范德华力，

      • 可逆性、饱和性、竞争性

      • 动态平衡，

      • 可作为药物储库：如果储存部位是药理作用的部位，就可能延长作用时间；若不是靶向部位则可能可能产生毒性。

      • 置换现象：对于一些结合率高的药物，与另一种与其竞争使结合率下降的药物作用，可使游离型药物大量增加，改变ADME和药效。（但较少考虑此办法）

  • 药物-蛋白复合物影响药效：

      • 不能透过血管壁向组织转运、

      • 不能由肾小球滤过排泄、

      • 不能经肝代谢。以此影响药物的体内分布，药物的代谢和排泄。

  • 药物与蛋白结合的影响因素：
      • 药物的理化性质：油水分配系数、扩散
      • 给药剂量：竞争抑制
      • 药物与蛋白质的亲和力：
      • 药物相互作用
      • 动物物种差异：较大（采用牛血清白蛋白研究药物蛋白结合率，不能正确反映药物与人血浆蛋白的结合）
      • 性别差异：雌性体内白蛋白的浓度高于雄性，水杨酸高于雄性
      • 生理和病理状态：年龄、肝肾功能不良，血浆蛋白量降低，血中游离型药物浓度高。

3. PK (pharmacokinetics )药代动力学 :

    反映药物在体内动态变化规律性的一些常数，定量描述了药物在体内经时过程的动力学特点及作用变化规律。

    在小鼠静脉注射或口服药物后的不同时间点采集小鼠血液进行LC-MS分析（利用液相色谱（LC）和质谱（MS）相结合的分析方法），已确定血液中药物含量。绘制药物浓度与时间的关系图，并根据PK试验结果计算药代动力学参数。

     今日话题所涉及主要关于血药浓度-时间曲线 –单次给药：

    3.1 受试动物数：一般每个剂量可选择3只进行预实验，在正式实验中每个采样点不少于 5 个，从同一动物个体多次取样，建议受试动物采用雌雄各半。

    3.2 采样点：采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和消除相。一般在吸收相至少需要 2~3 个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（Cmax）；在
Cmax 附近至少需要 3 个采样点；消除相需要 4~6 个采样点。整个采样时间至少应持续到 3~5 个半衰期，或持续到血药浓度为 Cmax 的 1/10~1/20。

    • 针对血管外给药，例如灌胃PO，一般采样时间点可设置为：15min,30min,1h,2h,4h,6h,8,h,12h（具体实验具体分析）

    • 对于静脉注射给药，应提供T1/2（消除半衰期）、Vd（表观分布容积）、AUC（血药浓度-时间曲线下面积）、CL
      （清除率）等参数值；

    3.3 剂量选择：动物体内药代动力学研究应设置至少三个剂量组，其高剂量最好接近 最大耐受剂量，中、小剂量根据动物有效剂量的上下限范围选取。

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        重要的PK参数含义，反映药物吸收的规律。

  • Cmax（达峰浓度） : 给药后出现的血药浓度最高值，反应药物在体内吸收速率和吸收速度的重要指标。

  • Tmax（达峰时间）：药后到达峰浓度所需的时间，反应药物进入体内的速度，吸收速度快则达峰时间短。

  • AUC（血药浓度-时间曲线下面积）：血药浓度曲线对时间轴所包围的面积。该参数是评价药物吸收程度的重要指标，反映药物在体内的暴露特性。

    • AUC0-t : 0时刻至最后一个可测时刻t的药时曲线下面积，根据梯形面积法得到
    AUC0-∞：0时刻至正无穷大时刻的药时曲线下面积，AUC(0-∞) = AUC(0-t) ＋Ct
    /λ z

    （t 为最后一次可实测血药浓度的采样时间；Ct为末次可测定样本药物浓度；λ z (末端消除速率)：末端相的血药浓度消除速率常数。将血药浓度取对数，对时间作线性回归后所得斜率值的负数为末端消除速率）。

  • T1/2（末端消除半衰期）：药物达到分布平衡后的血药浓度减少50%所需的时间，而不是血药浓度下降50%所需的时间。反映了药物从体内的消除速度。末端消除半衰期在数值上与末端消除速率成反比，即: 末端消除半衰期t1/2=0.693/末端消除速率λ z。半衰期数值越大，表示药物消除或分布过程越慢。t1/2=0.693/λ z=(0.693*Vd)/CL
    • 半经典的单隔室 PK 模型：以静脉给药或口服给药方式给药后，机体以一级速率（ka）吸收，且吸收速度比一阶消除速度更快的条件下，即消除常数 (λ z) 决定终末t1/2。
    • 当进入组织的药量=回到血中的药量，此时血药水平只因代谢和排泄消除而下降，可以将终末期对应为一种伪分布平衡状态（pseudo-equilibrium of distribution）。只有达到伪平衡时，药物的处置曲线才会变为单指数型。此时，体内的剩余药量的终末半衰期也等于剩余药量的消除半衰期（已经没有吸收和分布的因素）。
    • 在药物处置的终末阶段（伪平衡状态），药物衰减一级呈指数级模式，终末半衰期用 t1/2=0.693/λz 表示，其中 0.693 是 2 自然对数（In2=0.693），λ z即消除常数kel或半对数曲线终末相的斜率。
  • Vd（表观分布容积）:药物在体内达到动态平衡时体内药量与血药浓度的比例常数，单位一般为L。反映了药物在体内分布广窄的程度，数值越高表示分布越广。表观分布容积在数值上由清除率CL与末端消除速率λ z 的比值得到。 Vd=CL/λ z
  • CL （清除率）：肾在单位时间（一般用每分钟，min）内能将多少毫升血浆中所含的某些物质完全清除出去，这个被完全清除了某物质的血浆毫升数就称为该物质的清除率（ml/min）。反映机体对药物处置特性的重要参数，与生理因素有密切关系。清除率根据剂量与AUC(0-∞)的比值得到。CL=dose/AUC(0-∞)

  • MRT（平均驻留时间）：药物分子在体内停留时间的平均值，表示从体内消除63.2%药物所需要的时间。当药动学过程具有线性特征时才能计算该参数，其数值通过AUMC(药物与时间乘积对时间t的积分)与AUC(0-∞)的比值得到。

  • F（生物利用度）：药物被吸收进入血液循环的速度和程度的一种量度，是评价药物吸收程度的重要指标。（通常认为静脉注射利用度为 100%）

    • 绝对生物利用度：用于比较两种给药途径的吸收差异。

      计算公式为: F = (AUC_extDose)/(AUC_ivDose)100%，其中ext表示血管外给药，iv表示静注给药，Dose为剂量。

    • 相对生物利用度，用于评价两种制剂的吸收差异，

      计算公式为: F = (AUC_TDose)/(AUC_R*Dose)*100%，其中T和R分别为受试制剂和参比制剂。

4. PD(pharmacodynamics)药效动力学

主要研究内容：

4.1药物效应动力学：

研究药物对机体的作用及作用机制，包括药物与受体的相互作用、信号转导等。

4.2 药物剂量-效应关系

描述药物剂量与效应之间的关系，包括量效曲线、最大效应等

4.3 药物时间-效应关系

描述药物作用时间与效应之间的关系，包括失效曲线、达峰时间等。

5. PK-PD结合模型

将PK模型和PD模型结合起来，综合考虑药物在体内的代谢过程和对机体的作用，更准确地预测药物的疗效和安全性。

(由于内容太多先不细讲)

6. 确定动物体内药效剂量方法

6.1. 查文献或专利，参考化学结构相似的已知药物，特别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。

6.2. 通过其他动物换算

有一些药物可能只能查到人或大动物如猴子的数据，可以通过体表面积计算法进行换算得到所需动物的给药剂量。确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，耐受程度不同，所用剂量也不同。

 换算方法：体表面积法

先讲一下方法的原理：

目前大多数人用的方法是参考徐叔云教授主编《药理实验方法学》：

体表面积经验公式：体表面积S（m2）=体型系数R×体重W（kg）2/3

不同动物有不同的体型系数R：

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 因此DB=DA×AB÷AA=DA×（RB×WB2/3）÷（RA×WA2/3）=DA×(SB÷SA)

 D:用药剂量、A：体表面积、R:体型系数、S：体表面积

各动物在固定体重时体表面积比值：

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使用方法：由A动物折算B动物的药物剂量，则先在左列找到A动物，再在上行找到B动物，二者交叉处即是A、B两种动物体表面积的比值。

例如:某药物的人体给药剂量为100mg/kg，试计算小鼠的给药剂量应为多少？

①查表：人A与小鼠B的体表面积比值为0.0026

②换算：100mg/kg X 70kg = 7000mg，

③计算：7000mg X 0.0026 ÷ 20g = 910mg/kg

因此小鼠的给药剂量为910mg/kg

于是为方便计算有人总结得出不同动物间等效剂量比值：

误差属于数值修约导致的系统误差

图片图片

例如:某药物的人体给药剂量为100mg/kg，试计算小鼠的给药剂量应为多少？

①查表：当人体体重按60kg计算时，人与小鼠间等效剂量比值为8.51

②计算：100mg/kg X 8.51 = 851mg/kg

因此小鼠的给药剂量为851mg/kg

所以以后再进行动物间折算时可以先查两种动物的等效剂量比值，再进行剂量转换。

注意：

1. 各种动物对某药的敏感程度不一样，上述的折算关系中，没有考虑到种属差异，因为大动物相对于小动物更敏感，因此在实际计算中可以选择10%的安全系数。

例如:某药物的人体给药剂量为100mg/kg，试计算小鼠的给药剂量应为多少？

    ①查表：当人体体重按60kg计算时，人与小鼠间等效剂量比值为8.51

    ②计算：100mg/kg X 8.51 ÷ 10% = 8510mg/kg

2. 动物的体重需要接近表中标注的体重，偏差较大时会导致计算不准确。最好按照公式DB=DA×AB÷AA=DA×（RB×WB2/3）÷（RA×WA2/3）计算。（ D:用药剂量、A：体表面积、R:体型系数（见表1））

3. 不同的书籍的等效剂量比值可能有些许不同

6.3 通过PK结果确定

先按照经验选择高、中、低三个剂量，进行PK得到三个不同剂量的AUC0-t 。将体外活性结果EC50或EC80换算成血药浓度ug/mL，而后根据与三个剂量的交点以及要选择QD还是BID确定粗略估计药效起始浓度。

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6.4 剂量摸索方法

在观察一个药物的作用时，应该给动物多少的剂量是实验开始时应确定的一个重要问题。剂量太小，作用不明显，剂量太大，可能引起动物中毒致死，可以按下述方法确定剂量：

　　1．先用小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂量，一般可取1/10-1/5。

　　2．植物药粗制剂的剂量多按生药折算。

　　3．化学药品可参考化学结构相似的已知药物，特别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。

　　4．确定剂量后，如第一次实验的作用不明显，动物也没有中毒的表现（体重下降、精神不振、活动减少或其他症状），可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。

        5．用大动物进行实验时，开始的剂量可采用给鼠类剂量的十五分之一～二分之一，以后可根据动物的反应调整剂量。

        6. 确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同，以口服量为100时，灌肠量应为100-200，皮下注射量30-50，肌肉注射量为25-30，静脉注射量为25。                             

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