导语
结果：
scRNA-seq 中核苷酸代谢相关基因的富集评分
获得 12 个样本用于研究结直肠癌异质性，并使用单细胞测序数据评估肿瘤样本和正常样本之间的差异。在鉴定了 2000 个高度可变的基因之后，作者采用主成分分析 （PCA） 进行降维，重点关注前 20 个主成分 （PC）。随后，生成了 30 个簇，并引用了已知的标记基因来注释细胞亚群。使用 t 分布随机邻域嵌入 （t-SNE） 的可视化说明了不同的样本、组织类型、簇和注释的细胞亚群。通过热图描绘每个细胞亚群中标记基因的相对表达，计算为 Top5，此外，显示 12 个样品中不同细胞类型的百分比分布。小提琴图用于展示每种细胞类型中常见标记基因的表达模式。随后，作者根据 882 个核苷酸代谢相关基因的表达评估了 scRNA-seq 数据中核苷酸代谢水平。使用五种常见算法 （AddModuleScore、UCell、GSVA、AUCell 和 singscore），作者对基因集进行评分以评估核苷酸代谢。上皮细胞和髓样细胞的核苷酸代谢评分 （NMS） 相对较高。此外，作者比较了肿瘤和正常样本中各种细胞类型的 NMS，发现骨髓细胞、成纤维细胞、T/NK 细胞和上皮细胞等细胞中的 NMS 在肿瘤中相对较高此外，对肿瘤和正常组织中的上皮细胞进行了差异分析，确定了总共 102 个 NMRGs，在两种环境中具有表达差异（补充表 3）。
scRNA-seq 中细胞相互作用的分析
细胞轨迹分析为单细胞分辨率下的细胞分化关系、发育轨迹和肿瘤免疫细胞动力学的变化提供了有价值的见解。在作者的研究中，作者利用“单片”R 包来确定肿瘤组织中上皮细胞的细胞轨迹和伪时间分布，确定了上皮细胞在发育过程中总共有 5 种细胞状态，其中第 5 簇对应于细胞发育的结束状态，在上皮细胞发育的各个阶段差异表达最高的前 40 个核苷酸代谢相关基因的表达模式，例如，突出了上皮细胞发育结束时 ACOX1 的主要高表达。作者根据肿瘤组织中所有上皮细胞的核苷酸代谢评分 （NMS） 中位数，将上皮细胞分为核苷酸代谢 （NM） 高组和 NM 低组。然后使用气泡图来可视化信号通路活性分析的结果，例如，揭示了具有高核苷酸代谢评分的上皮细胞中增强的 Notch 信号通路活性，尤其是成纤维细胞。从分子病理学的角度来看，DNA 突变的积累，特别是在 Notch 信号通路内的分子中，在恶性肿瘤的发展中起着至关重要的作用（Meurette 和 Mehlen 2018）。不同细胞类型之间配体-受体信号转导的强度，上皮细胞表现出较高的核苷酸代谢评分，显示出与成纤维细胞的更强细胞通讯。进一步的分析揭示了高分上皮细胞和成纤维细胞之间加强的配体-受体对关系，以 TGFA-EGFR 相互作用为例。阿拉伯数字在许多恶性肿瘤中观察到的 TGF-α/EGFR 自分泌环的异常激活强调了它与肿瘤发生和进展的密切关联（Tang 等人，2016 年）。最后，作者推断了核苷酸代谢评分较高的上皮细胞和成纤维细胞之间存在配体-受体关系和相应的转录因子 （TFs） 中，阐明了肿瘤微环境中细胞相互作用的潜在调节机制
空间转录组测序中核苷酸代谢的表征
作者采用 SCTransform 的方法来校正空间测序深度，并进行了一系列归一化过程，从而在降维聚类后在空间中识别了 14 个不同的细胞亚群。值得注意的是，亚群 1 、 3 、 4 和 11 主要位于结直肠癌的肿瘤核心，如空间转录组的原始表示所示。。使用 “scMetabolism” R 软件包进一步分析不同细胞亚群的代谢活性。位于肿瘤核心区域的亚群 1、3、4 和 11 与嘌呤和嘧啶代谢活性密切相关，这种代谢活性富集主要在肿瘤的核心区域观察到，随后，使用 Python 的 Scanpy 和 stlearn 包，作者对空间分辨的细胞亚群进行了细胞发育轨迹分析。在空间转录组数据的归一化和聚类之后，总共确定了 11 个不同的细胞亚群。有趣的是，位于肿瘤核心区域的簇 1 表现出向肿瘤外围区域的簇 8 的分化，如轨迹分析中观察到的那样。此外，作者采用 RCTD 方法将注释的细胞类型从单细胞数据向后卷积到空间数据，推断每个空间位置的主要细胞类型。核苷酸代谢评分高的上皮细胞主要位于肿瘤的核心区域，而得分低的上皮细胞主要集中在肿瘤的外围区域.最后，根据 MISTy 的结果，核苷酸代谢评分较高的上皮细胞显示出聚类的一致性，并且与内部空间中成纤维细胞的空间相互作用具有更高的相关性。
构建与核苷酸代谢相关的预后模型
为了利用核苷酸代谢相关基因特征的潜力来支持临床决策，作者利用 102 个表达分化的 NMRGs 开发了结直肠癌的预后模型。这些模型是使用高通量测序数据和微阵列数据构建的。作者的方法涉及利用由 584 个 CRC 样本组成的训练集和来自 TCGA 数据集的可用生存数据来构建预后风险模型。此外，作者使用了 232 和 579 个 CRC 患者样本以及来自 GSE17538 和 GSE39582 队列的生存信息进行外部验证。最初，作者进行了单变量 Cox 分析，以确定 5 种 NMRG 显着影响 CRC 患者的 OS。为了解决过拟合的风险并改进用于 OS 预测的基因选择，进行了 LASSO 回归分析，从最初的 5 个候选基因中选择了 4 个候选基因。随后，逐步多因素 Cox 分析确定 ACOX1 、 ALDOB 、 CPT2 和 TKT 是独立的预后因素。然后通过将单个基因的表达水平相加来计算风险评分，每个基因由其相应的回归系数加权。以中位评分为分界点，将患者分为低风险组和高风险组。对 TCGA 训练组和 GEO 验证组进行的生存分析一致表明，与低风险组相比，高风险组患者的 OS 较差。此外，高危患者表现出较差的无进展生存期 （PFS） （补充图 1A）。此外，受试者工作特征曲线说明了 TCGA 队列中 OS 风险评分的强预测能力，风险图提供了 TCGA 队列以及 GSE17538 和 GSE39582 队列中个体患者的详细生存结果。这些发现强调了作者基于核苷酸代谢相关基因特征的预后模型的潜在临床效用，为 CRC 患者的个性化治疗策略提供了有价值的见解。
临床特征的验证和列线图的构建
考虑到作者基于核苷酸代谢的风险模型与不良预后之间观察到的强相关性，作者试图评估作者的 4-NMRG 特征作为结直肠癌患者独立预后预测因子的潜力。在 TCGA 队列中，作者进行了单变量 Cox 分析，揭示了风险评分可以作为独立的预后指标，超过其他常见临床特征（如年龄、分级、分期和组织学类型）即使在多因素分析之后，这种趋势仍然存在，进一步确立了风险评分作为队列中最可靠的独立预测因子，与这些发现一致，在 GEO 外部验证队列中，风险评分证明了其作为患者独立预后指标的潜力（补充图 1B、C）。为了提高作者风险模型的临床实用性并帮助临床医生做出明智的决策，作者开发了一个列线图，用于根据临床病理特征和风险评分之间的相关性预测 CRC 患者的 1 年、3 年和 5 年生存率，风险评分显示对 OS 预测的影响更大，强调了作者基于 4-NMRG 的风险模型的卓越预后潜力。校准曲线证实了列线图预测的准确性，而 3 年时的曲线下面积 （AUC） 显著优于其他临床病理特征。3 年时的决策曲线分析曲线和 C 指数值一致表明，作者构建的列线图和风险评分提供了最高的净收益，超过了传统模型，从而对临床决策产生了更实质性的影响。作者使用热图进一步说明了风险分组、临床特征和作者四个建模基因的表达之间的关联。卡方检验显示风险分组与患者分期和组织学类型之间存在显著关联。有趣的是，所有四个模型基因在低风险组中都表现出较高的表达，高危组表现出更晚期的分期。这些分析加强了风险评分和列线图作为临床预测评分系统的可靠性。
突变景观和微卫星不稳定性
免疫治疗的疗效在不同肿瘤患者之间往往差异很大，除了与肿瘤类型、病理分期和免疫浸润相关的因素外，基因突变也可能影响免疫治疗的疗效。瀑布图说明了 CRC 患者的体细胞突变谱，其中这些基因最常见的突变形式是错义突变。包括各种突变分类的统计图、碱基改变的汇总图、样本中各种突变分类的箱线图、突变数量最多的 10 个基因的统计图、每个样本中包含的突变计数数图以及样本百分比曲线。作者检查了 CRC 中风险评分亚组中最常见突变基因的分布。相对于低风险评分亚组的患者，高风险评分亚组的患者表现出更高的肿瘤突变负荷 （TMB），接下来，作者根据 TMB 中位值和中位风险评分（high-TMB+ 高风险评分、high-TMB+ 低风险评分、low-TMB+ 高风险评分和低 TMB+ 低风险评分）将患者分为四组，结果显示高风险评分和低突变的患者 OS 相对较差，当 DNA 错配修复功能异常时，微卫星中发生的复制错误会导致微卫星不稳定 （MSI）。微卫星不稳定性按程度分为微卫星高不稳定性 （MSI-H）、微卫星低不稳定性 （MSI-L） 和微卫星稳定性 （MSS）。与 MSI 低组相比，CRC 中的 MSI 高组具有更高的风险评分。
免疫浸润和生物学机制的预测
肿瘤微环境 （TME） 是患者临床结果和治疗反应的关键决定因素。肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 由各种细胞类型（如效应细胞、调节细胞和炎症细胞）组成，参与由细胞因子和可溶性因子介导的复杂相互作用。此外，肿瘤细胞本身会释放免疫抑制细胞因子，从而影响微环境中的免疫细胞募集。因此，细胞的组成及其与 TME 中细胞因子的相互作用共同塑造了抗肿瘤免疫反应 。在这项研究中，作者使用各种算法探索了高风险评分组和低风险评分组的免疫景观。为了更深入地研究风险评分与免疫相关功能之间的关系，作者使用 ssGSEA 方法评估了不同免疫细胞亚群和功能的富集评分。作者的研究结果显示，高风险评分组表现出免疫细胞浸润评分升高和免疫通路评分升高。作者采用“估计”方法通过计算不同风险组的基质细胞和免疫细胞比率来估计肿瘤纯度。考虑到免疫检查点分子对肿瘤免疫治疗的显着影响，作者分析了不同风险评分亚组中免疫检查点基因的表达，揭示了高风险评分组中几乎所有免疫检查点的表达水平较高。 热图描述了各种风险评分组的免疫检查点基因、免疫评分、免疫细胞浸润和肿瘤微环境评分。
此外，作者研究了 RNA 干性评分 （RNAss） 与风险评分之间的相关性，发现了显着的负相关。这表明风险评分较低的 CRC 细胞表现出更突出的干细胞特征和较低的细胞分化水平。这些发现意味着高危评分组患者的预后可能较差，伴有免疫活性增强，可能表明结直肠癌中存在免疫抑制性肿瘤微环境。这可能会导致对免疫治疗的反应率降低。
此外，作者的风险评分特征显示与各种致瘤途径呈很强的正相关，包括上皮-间充质转化、血管生成和 NF-KB 信号通路，值得注意的是，作者观察到风险组之间核苷酸代谢相关通路存在显著差异，两个核苷酸代谢相关风险亚组之间的差异表达基因 （DEGs） 富集于激素代谢和代谢相关疾病中（根据源自基因集富集分析 （GSEA） 的基因本体论 （GO） 和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 术语，作者注意到低风险组和高风险组之间存在不同的富集模式。具体来说，低风险组表现出核苷酸代谢和氮代谢的富集，而高危组表现出 JAK-STAT 和肿瘤坏死因子 （TNF） 信号通路的显著富集。
免疫疗法和化疗效果的预测
肿瘤免疫疗法，尤其是免疫检查点抑制剂 （ICB），通过激活 T 细胞、逆转 CD8 T 细胞耗竭和刺激免疫细胞识别和消除肿瘤细胞，改变了癌症治疗。然而，ICB 的有效性仅限于一部分肿瘤患者，其中许多患者没有获得长期益处。为了加深作者对风险评分如何影响免疫治疗的理解，作者利用 TIDE 和 IPS 评分来评估肿瘤和区域淋巴结患者，评估他们产生免疫功能正常反应的潜力。这种方法旨在更有效地识别免疫治疗的合适人选，认识到免疫治疗的疗效可能因免疫浸润水平而异，而免疫浸润水平通常受肿瘤进展的影响。在这些发现的基础上，作者探索了预测结直肠癌患者对免疫检查点阻断 （ICB） 反应的预后模型的可行性。小提琴图说明了 IPS 与风险组之间的关系，IPS 值越高表明对 PD-1 和 CTLA-4 抑制剂的反应可能性更高。值得注意的是，低风险组中的个体对免疫检查点抑制剂，尤其是 CTLA-4 抑制剂表现出优异的免疫反应。由于免疫微环境调节 ICB 反应，作者对风险评分与 ICB 反应特征之间的相关性进行了深入分析。作者的研究结果显示，风险评分与蛋白酶体和 APM_signal 之间存在显著的正相关，同时与其他 ICB 反应属性呈显著负相关。此外，风险评分与肿瘤免疫周期的关键阶段表现出实质性和有意义的关联，包括癌细胞抗原释放（第 1 步）、癌抗原呈递（第 2 步）、起始和激活（第 3 步）以及免疫细胞浸润到肿瘤中（第 4 步）。
为了进一步研究不同亚组之间免疫反应的差异，作者进行了涉及 12 个模型基因和经典免疫相关基因的相关性分析。较高的肿瘤 TIDE 预测评分与对免疫检查点阻断 （ICB） 的反应性降低和患者生存率降低相关。作者的研究结果显示，高风险评分组中的个体表现出较高的功能障碍和排除评分，以及相对较高的 TIDE 评分，最后，作者探讨了风险评分与三种临床使用的化疗药物的 IC50 值之间的关系。作者的研究结果显示，风险评分与顺铂、伊马替尼和阿霉素的 IC50 值之间存在显著的负相关，综上所述，这些结果表明，低风险组中的个体可能更有可能同时从免疫疗法和化疗中受益。
ACOX1 + 和 CPT2 + 肿瘤细胞可作为免疫治疗的预后影响因素和靶点
共有 4 个核苷酸代谢相关基因 （ACOX1 、 ALDOB 、 CPT2 和 TKT ） 被纳入作者的风险模型。空间图说明了这四个基因的表达模式。在作者的 scRNA-seq 分析中，作者将上皮细胞分为两组：表达四个基因的细胞（表达阳性）和不表达它们的细胞（表达阴性）。利用 ssGSEA 算法，作者根据对阳性表达上皮细胞的特异性标记基因估计了 TCGA 数据集中这些细胞的丰度。对于生存分析，作者确定了最佳临界值，随后将 TCGA 数据集中的 CRC 患者分为两组。
ACOX1 + 和 CPT2 + 上皮细胞比例较高的患者表现出相对更有利的预后，并且对免疫治疗有效反应的可能性更高。相反，TKT + 上皮细胞比例较高的患者预后相对较好。然而，正如 TIDE 分析所示，产生或未产生有效免疫反应的患者之间的细胞比例差异在统计学上不显著（补充图 2B）。尽管 ALDOB + 上皮细胞比例较高的患者也表现出相对较好的总生存期，但对数秩测试结果显示两组之间没有显着差异（补充图 2D）。这些发现表明 ACOX1 和 CPT2 表达阳性上皮细胞可能是结直肠癌患者的保护因子。
采用RCTD方法将单细胞数据中注释良好的细胞类型反向卷积为空间数据，的有趣的是，对空间中细胞通讯关系的外推显示，与表达 ACOX1 的阳性上皮细胞相比，表达 ACOX1 阴性的上皮细胞与成纤维细胞的细胞相互作用更强，同样，表达 CPT2 阴性的上皮细胞也显示出与成纤维细胞的细胞通讯增强。
作者使用 IHC 方法评估了 ACOX1 和 CPT2 在 80 对结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达。作者的结果表明，与正常组织相比，ACOX1 和 CPT2 在结直肠癌组织中显著下调，最后，作者通过 PCR 检测比较了正常肠上皮细胞和 4 种 CRC 细胞系中 ACOX1 和 CPT2 的表达水平，发现肿瘤细胞中 ACOX1 和 CPT2 基因的表达水平显著下调，这些结果强烈支持 ACOX1 和 CPT2 作为 CRC 诊断和预后的生物标志物的潜力。随后，在转染 5 天后使用 qRT-PCR 评估 ACOX1 和 CPT2 的表达水平，以验证 ACOX1 和 CPT2 的 siRNA 敲低在 RKO 和 HCT116 细胞系中的影响，根据敲低效率，作者选择 1 号和 2 号 siRNA 敲低细胞系进行 ACOX1 相关功能实验，而 2 号和 3 号 siRNA 敲低细胞系进行 CPT2 相关功能实验。
随后，CCK-8 细胞实验表明，敲除诱导的 ACOX1 和 CPT2 减少显著增强了 RKO 和 HCT116 细胞系的增殖，转染 si-ACOX1 和 si-CPT2 的肿瘤细胞在 transwell 测定中也表现出增强的迁移和侵袭，总之，这些发现表明 ACOX1 和 CPT2 是结直肠癌的癌基因。
总结
本研究利用单细胞测序和空间转录组学分析了结直肠癌中核苷酸代谢相关的基因表达，揭示了细胞亚群特异性变异。该研究阐明了核苷酸代谢、CRC 免疫逃逸和耐药性之间的复杂关系，从而创建了患者生存的预测风险评分模型。该模型与免疫治疗反应、化疗效果、基因突变和肿瘤微环境相关，突出了其临床意义。此外，ACOX1 和 CPT2 被确定为 CRC 的潜在预后指标，表明它们可能作为治疗靶点。这些见解增进了我们对 CRC 发病机制的了解，并可能指导定制治疗方法的开发。