肝细胞癌（HCC） 是原发性肝癌中最常见的一种，占病例的大部分。晚期HCC侵袭性强，预后差。根据WHO数据，HCC是全球第六大常见肿瘤，第三大致死癌症，五年生存率约18%。早期HCC患者有多种治疗选择，如手术、消融术和肝脏移植，手术切除尤其适用于局限性肿瘤患者。尽管治疗方案多样，但早期诊断困难，晚期患者需化疗栓塞和全身治疗。索拉非尼是FDA批准的晚期HCC标准治疗药物，但耐药性限制了其效果。因此，对于HCC治疗的突破性进展仍需进一步研究 。
四物汤（SWD） ，是补血调经、滋补肝肾 的传统良方，由当归、川芎、白芍及熟地黄四味药材构成，临床上主要用于治疗严重贫血、月经失调、痛经等症状。该方剂中的有效成分涵盖了有机酸、苷类、内酯类、黄酮类及生物碱类等。现代药理学研究揭示，这些成分具备抗肿瘤、护肝、抗氧化及镇痛 等多重药理活性。此外，SWD与其他药物并用，通常能展现出更佳的治疗效果。
日前，一篇题为“Siwu decoction suppress myeloid-derived suppressor cells through tumour cells necroptosis to inhibit hepatocellular carcinoma ”的研究文章，深入探讨了SWD 在抑制HCC方面的潜在作用机制。
图1 论文首页
SWD对HCC细胞的生长有抑制作用
图2A展示了SWD的组成，研究采用高效液相色谱法（HPLC）对SWD 的化学成分进行了分析，成功鉴定出五种特征化合物（图2B）。此外，研究将表达荧光素酶的MHCC97L细胞源性皮下肿瘤植入小鼠左叶，体积为1mm3。并将实验小鼠随机分为三组（每组n=6），每两天一次分别给予蒸馏水（灌胃200 μl）、低剂量SWD（0.758 g/kg，灌胃200 μl）和高剂量SWD（1.516 g/kg，灌胃200 μl），连续治疗四周，干预期间，小鼠体重未发生明显减轻（图2C）。研究还在移植后每周向小鼠注射D-荧光素钠盐（15 mg/kg,i.p），并利用IVIS系统观察动物。结果显示，在第四周时，低剂量和高剂量SWD组的荧光信号强度均低于对照组，且高剂量组的荧光信号强度低于低剂量组，表明SWD治疗能以剂量依赖性方式抑制小鼠肝脏中HCC的生长 （图2D）。
随后，研究对肝脏进行解剖并测量肿瘤大小，进一步证实了SWD干预对HCC的抑制效果（图2E）。组织学检查显示，对照组肿瘤边界模糊，向邻近肝组织浸润，而SWD组肿瘤边界清晰，表明SWD能够抑制HCC肿瘤的局部浸润（图2F）。研究还观察了HCC细胞的转移情况，发现高剂量SWD组未见明显荧光素信号，表明高剂量SWD能显著阻断HCC向肺组织的转移（图2G）。同时，心脏、脾脏、肾脏和肠道等主要器官，亦未发现形态学变化，表明SWD干预小鼠的主要器官在外观和组织学上均未见异常（图2H）。综上所述，SWD是一种有效且安全的抑制HCC的中药配方 。
图2 SWD抑制HCC的体内生长
SWD在体内外均可诱导HCC的坏死反应
为深入探究SWD对HCC的抑制效应，研究对SWD处理与否的小鼠肿瘤组织切片中肿瘤增殖标志物Ki67和微血管标志物CD31的表达进行了检测。结果显示，SWD显著降低了Ki67和CD31的表达水平，这暗示了SWD处理能够抑制肿瘤的生长及HCC内部的血管生成（图3A）。为验证这一效应是否与SWD对HCC细胞的直接细胞毒性相关，研究在体外对人HCC细胞系MHCC97L、Huh7和PLC/PRF/5进行了培养，并施以不同浓度的SWD处理。结果显示，SWD对这三种细胞系均表现出剂量依赖性的细胞毒性，而对正常肝实质细胞AML12的影响则微乎其微。特别是MHCC97L细胞系对SWD的IC50值最高（33.12±3.30 mg/ml），表明其对体外SWD的敏感性较低（图3B）。这提示，SWD的抗HCC作用不仅与其对肿瘤细胞的直接影响相关，还可能与其对肿瘤微环境（TME）的调节作用有关 。
为了进一步阐释SWD如何发挥其抗HCC作用，研究比较了SWD处理组与未处理组的组织学差异。结果显示，SWD处理组的肿瘤坏死面积大于对照组（图3C）。Western blot分析显示，SWD在体外处理时能够剂量依赖性地诱导MHCC97L和PLC/PRF/5细胞的坏死反应，表现为RIPK1、RIPK3和p-MLKL表达的增加，进而促进HCC细胞产生IL-1B（图3D）。随着SWD剂量的增加，RIPK3、Caspase8、MLKI和IL-1B的表达亦相应增加，表明SWD能够剂量依赖性地诱导小鼠HCC的坏死反应（图3E）。免疫组织化学分析揭示，SWD能够诱导HCC肿瘤中心及边缘区域的坏死反应，而边缘区域的肿瘤细胞更多地诱导RIPK3和caspase8的表达（图3F）。这些发现表明，SWD诱导的HCC细胞坏死反应可能是触发主要位于肿瘤边缘TME中另一组细胞凋亡的原因 。
图3 SWD诱导HCC在体内外的坏死反应
SWD诱导的HCC细胞坏死反应触发MDSCs凋亡
为深入研究肿瘤微环境（TME）中的潜在细胞靶点，研究对先天免疫细胞进行了分析，涉及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓源性抑制细胞（MDSCs）。结果显示，SWD对TME中CD11b+F4/80+ TAMs细胞的数量影响甚微，但其对CD11b+Ly6G+细胞的数量具有剂量依赖性的显著抑制作用（图4A）。为明确CD11b+Ly6G+群体的特性，研究对细胞进行了分类，并将其与从C57BL/J小鼠脾脏中分离的CD3+CD8+细胞毒性T细胞共培养（图4B）。结果显示，细胞毒性T细胞与未经处理小鼠的CD11b+Ly6G+细胞共培养时，细胞增殖及活化标志物Ki67和颗粒酶B显著受抑，而经SWD处理的小鼠CD11b+Ly6G+细胞对细胞毒性T细胞增殖和活化的抑制作用相对较弱（图4C）。这表明TME中SWD针对的CD11b+Ly6G+细胞更可能属于MDSCs。此外，SWD处理后，小鼠的MDSCs数量未见明显变化（图4D）。
研究发现，SWD不影响经PH K-26染色的MDSCs向HCC小鼠体内的迁移。但SWD干预显著抑制了TME中MDSCs的局部增殖（图4E），表明SWD干预抑制了HCC的TME中MDSCs的局部扩张。为进一步探究SWD对HCC的TME中MDSCs群体的调节作用，研究在体外对MDSCs进行了SWD处理。结果显示，在含有SWD的培养液中，MDSCs群体数量未见显著变化（图4F），表明SWD对MDSCs的成熟和分化无影响。SWD对诱导MDSCs细胞凋亡亦无影响，说明SWD对MDSCs无直接作用（图4G）。 为确定SWD是否调节MDSCs与HCC细胞之间的细胞间通讯，研究对HCC细胞进行了SWD处理，并收集了处理后的HCC细胞培养上清（图4H）。SWD处理的HCC培养上清对体外MDSCs群体具有显著抑制作用。进一步分析显示，在SWD处理的HC C培养上清液存在下，MDSCs更易发生细胞凋亡（图4I）。这表明，SWD通过调节HCC细胞与MDSCs之间的相互作用，从而抑制TME中的MDSCs群体 。
图4 SWD诱导的HCC细胞坏死反应触发了MDSCs的凋亡
体内联合使用SWD和索拉非尼可提高索拉非尼治疗HCC的疗效
研究进一步探究了SWD与索拉非尼联合应用在治疗HCC方面的潜力。实验中，HCC小鼠分别接受蒸馏水（对照组）、索拉非尼（15 mg/kg）、SWD（1.516 g/kg）以及索拉非尼与SWD联合灌胃治疗，持续4周。在联合治疗组的小鼠中，并未观察到体重减轻的现象（图5A）。尽管索拉非尼和SWD单独使用均能抑制HCC小鼠肿瘤的进展，但联合治疗在肿瘤消退方面展现了更佳的疗效（图5B）。 随后，研究对治疗后的小鼠肝脏及其他主要器官进行了解剖，结果显示，联合治疗组小鼠的肿瘤体积显著小于单独接受索拉非尼或SWD治疗的小鼠（图5C）。索拉非尼、SWD以及联合治疗组的荧光素酶信号明显低于对照组（图5D）。此外，心脏、脾脏、肾脏和肠道的外观及组织学特征在各组间未见显著差异（图5E）。流式细胞术分析结果表明，索拉非尼单独治疗未能抑制TME中的MDSCs，而SWD单独使用可能减少其数量。然而，与单独使用SWD相比，联合使用索拉非尼和SWD并未导致TME中MDSCs的进一步减少（图5F），这暗示SWD和索拉非尼可能通过不同的机制抑制HCC。由此可见，SWD与索拉非尼的联合使用能够增强索拉非尼治疗HCC的疗效，并且未见明显毒性反应 。
图5 SWD联合使用改善了索拉非尼对HCC的疗效
结论
总之，源自中国传统医药的SWD配方能够激发肝癌细胞的坏死过程，并间接作用于免疫抑制细胞MDSCs，从而对HCC展现出抑制效果 。 Feng Z, Chan YT, Lu Y, Wu J, Xing T, Yuan H, Feng Y, Wang N. Siwu decoction suppress myeloid-derived suppressor cells through tumour cells necroptosis to inhibit hepatocellular carcinoma. Phytomedicine. 2024 Oct;133:155913. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155913
