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具有核特异性特性的脑类器官为更精细地研究人类大脑发育和疾病提供了独特的平台，但仍具有挑战性。在一项新的研究中，上海科技大学向阳飞及其团队利用人类多能干细胞的定向三维分化，开发了一种具有延髓脊髓三叉神经核团（SpV）的人类脑区特异大脑类器官，还创建了SpV和丘脑之间的三叉丘脑投射。该研究为研究人类SpV、相关神经回路和脑部疾病提供了一个可行的模型。

脑类器官代表了揭开人类大脑生物学的前沿策略，尽管各种区域特异性脑类器官已被建立，但试图重现脑核特异性特征的努力仍处于早期阶段。考虑到大脑中功能核团的多样性，具有核团特征的区域特异性脑类器官的可用性仍然有限，而且核团特异性脑回路尚未用人类细胞建模。再现核特异性特征的区域特异性脑类器官将有助于更精确和深入地了解人类大脑。SpV是横跨整个脑干的最大颅神经核，是三叉神经核的重要组成部分之一。虽然SpV在感觉处理和调节、神经痛病因学甚至病原体引起的病理反应中发挥着重要作用，但目前还没有针对人类SpV的模型。本研究中，研究团队应用了人类多能干细胞的定向三维分化，开发了一种产生具有延髓SpV特异性标签的人类区域特异脑类器官的方法，即人类延髓SpV样类器官（hmSpVOs）。该研究为未来人类SpV、相关神经回路和相关脑部疾病的研究提供一个可行的体外模型。

研究人员报告了一种将人类多能干细胞分化为区域特异性脑类器官的方法，即人类延髓SpV样类器官（hmSpVOs）。还通过单细胞转录组分析了hmSpVO发育过程中的谱系分化，并分析了hmSpVO的结构和功能成熟。随后，研究人员通过将hmSpVOs与丘脑类器官（hThOs）融合，以在SpV和丘脑之间创建三叉神经-丘脑投射。该研究为理解人类大脑中SpV的发育、相关神经回路和相关疾病提供了一个平台。

1. 从hPSCs中生成hmSpVOs

研究人员将溶解的Matrigel（1% v/v）添加到hmSpVO培养物中，以辅助神经上皮组织的折叠。hmSpVOs重复序列的RNA测序（RNA-seq）分析进一步验证了其与hESCs和之前建立的人类皮质类器官（hCOs）之间的不同，同源盒（Homeobox，HOX）基因同源组3-4的表达还揭示了hmSpVOs与延髓发育的尾部后脑之间的相关性。研究人员还证实，与hCOs、hThOs和hESCs相比，H9和H1 hESC细胞系以及hiPSC细胞系RC01001A和RC01001B可以在hmSpVOs分化过程中建立相似的头尾同源性。RNA-seq分析还显示，虽然hmSpVOs复制与dBLb、dBLa及其相关dB1结构域显示出高度的相似性，但当采用腹侧模式时，这种区域特异性的一致性可能会减弱，再次表明了hmSpVOs中SpV发育的相关性。然后，研究人员通过免疫染色验证了hmSpVOs中SpV相关谱系的产生，发现早期（第16天）hmSpVOs富集PAX7⁺和SOX2⁺祖细胞，并开始产生PAX2⁺和LMX1B⁺；相比之下，除了SOX2⁺祖细胞的存在，hThOs和hCOs均未显示这些类型的细胞的大量产生；PAX2和LIM同源盒1/5（LHX1/5）阳性细胞，只在hmSpVOs中产生，而在hThOs和hCOs中不产生。经过较长时间的培养，hmSpVOs中可以产生大量的LMX1B⁺细胞和PAX2⁺/LHX1/5⁺细胞，分别表明与spv相关的兴奋性和抑制性神经元谱系的发展。此外，同源结构域因子LBX1在hmSpVOs中广泛表达，但在hThOs或hCOs中不表达。hCOs和hThOs能够分别产生TBR1⁺皮质神经元和TCF7L2⁺丘脑神经元，而这两种神经元在hmSpVOs中几乎不产生，再次表明hmSpVOs具有不同的区域特性（图1）。

图1 从hPSCs中生成hmSpVOs

2. 单细胞转录组学揭示了hmSpVOs中的SpV谱系特异性

为了进一步分析hmSpVOs的区域特征和谱系特征，研究人员在两个发育时间点（第30日和第62日）分析了来自hmSpVOs的7214个细胞的单细胞转录组，UMAP确定了14个簇，这些簇被进一步分为5种主要的细胞类型，包括神经祖细胞（NPC）、中间祖细胞（IP）、未成熟神经元（IM）、ExN和InN。为了了解hmSpVOs的区域特性，研究人员将类器官图谱与人类胎儿脑图谱整合，结果显示hmSpVOs与人脑延髓最相似。通过检测SpV发生的典型标记物dBLa和dBLb的表达，发现在体内，dBLa特异性基因如PAX2、LHX1和LHX5主要在InN组中表达，而dBLb特异性基因如TLX3、LMX1B和POU4F1主要在ExN组中表达；LBX1是B类神经元的标志物，也定义了体感命运，除NPC外，它在各种细胞簇中广泛表达。对后脑不同发育结构域的基因标签进行的分析再次表明，hmSpVOs中的InN和ExN分别与dBLa和dBLb结构域最为相似。

为了进一步验证亚区域特异性的一致性，研究人员使用Allen Brain Adult human数据库比较了hmSpVOs和不同的人类髓核的转录组标签，发现hmSpVOs来源的细胞与人SpV最相似。此外，研究人员分析了hmSpVOs中不同细胞类型的发育轨迹，发现从NPC组到InN和ExN组有一个明显的早期到晚期的过渡；虽然NPCs和IPs表现出最早的发生，但在hmSpVOs中，InN表现出比ExN更早的发生。对不同推断状态下的基因表达进行分析也发现了3个主要的基因簇，其中与祖细胞相关的基因如VIM、SOX2和PAX7的表达出现最早，并随着时间的推移而下降；随后是一簇定义躯体感觉命运的基因，如LBX1，以及对抑制性神经发生至关重要的基因，如LHX1和LHX5；兴奋性神经发生的关键调节因子，如TLX3和POU4F1，开始在最新的簇中表达。通过SCENIC进一步验证了必需转录因子与相应细胞类型的相关性，提示它们在SpV发育过程中在细胞命运决定中的作用。对参与SpV、皮质或丘脑发育的特定细胞群进行的定量分析进一步验证了hmSpVOs与hCOs和hThOs相比具有不同的区域特性（图2）。总之，hmSpVOs再现了髓质SpV的谱系特征，并有助于解剖神经发生和人类SpV发育中的关键调节因子。

图2 hmSpVOs的单细胞转录组分析

3. hmSpVOs的长期结构和功能成熟

为了有利于hmSpVOs的长期发育，特别是促进投射轴突的生长，研究人员制备了300mm的dhmSpVO切片并在气液界面培养。染色结果显示，在气液界面培养3个月的hmSpVOs含有LMX1B⁺和PAX2⁺细胞，与早期阶段一致。对来自多个hPSC系的长期培养的hmSpVOs进行的定量分析显示，存在类似的PAX2⁺和LMX1B⁺细胞。为了了解完整hmSpVOs的结构，进行了全组织块染色，发现示hmSpVOs在4个月以上的长期培养后显示出丰富的轴突和树突，在类器官边缘之外，MAP2⁺树突和NF⁺轴突均显示出随机的空间组织。对不同阶段的hmSpVOs进行量化表明，这条边缘丰富的轴突通路出现在较长时间的培养（即超过120天）后；长期培养后，来自其他hPSC细胞系的类器官也同样发育出边缘富集的轴突通路。在从hmSpVOs制成的细胞中，病毒标记与突触后蛋白突触后密度95（PSD95）和抑制性突触后蛋白Gephyrin的染色相结合，提示了分化神经元中突触的发育。通过GFAP与S100β共染色进一步验证了GFAP⁺细胞的星形胶质细胞特性。为了评估hmSpVOs的电生理活动，研究人员使用多电极阵列（MEA）系统进行了细胞外记录，发现GABA受体激动剂（muscimol、R-baclofen）或谷氨酸受体拮抗剂（AP5、CNQX）的药物干预显著降低了hmSpVOs的峰电位；而通过Bicuculline阻断GABAergic传递显著增加了峰电位，提示hmSpVOs中同时存在GABA能和谷氨酸能神经传递。此外，考虑到大脑中的SpV神经元可以对外周感觉神经元释放的神经肽做出反应，研究人员用CGRP刺激hmSpVOs，发现CGRP处理显著增加了hmSpVOs中的峰事件（图3）。总之，这些结果表明hmSpVOs可以在发育过程中建立结构和功能的成熟。

图3 hmSpVOs的结构和功能发展

4. hmSpVOs和hThOs融合模型三叉神经丘脑投射

hmSpVOs的产生和之前建立的hThOs使得研究人员可以在体外构建这种脑-核特异性神经环路。为此，研究人员将hmSpVO和hThO截面在气液界面融合，产生hSTOs。通过mCherry⁺ hmSpVO与未标记的hThOs融合制备的hSTOs的实时成像显示，mCherry⁺过程从hmSpVO细胞稳健地投射到hThO区域。研究人员对不同融合条件下冷冻切片中的轴突投影进行了定量分析，发现hmSpVO-hThO的投影在融合后随着时间的推移而增加；hmSpVO向hThO方向的投射事件显著高于向hCO方向的投射事件；虽然hThOs显示了向hmSpVOs的轴突生长，但融合的轴突通路的大小显著小于hmSpVO-hThO和hThO-hCO的投影。因此，轴突投射模式可能取决于融合脑类器官中连接神经组织的类型。SYP的免疫染色显示，在hThOs中，mCherry⁺ hmSpVO衍生的投射包含SYP+点状点，表明在三叉神经丘脑靶向过程中存在突触发生。此外，研究人员还发现经过长期培养，即类器官融合后1个月左右，在hSTOs中，丘脑侧富集了TCF7L2⁺丘脑细胞，而hmSpVO侧富集了PAX2⁺和LMX1B⁺ SpV细胞。这些结果表明，hSTOs在发育过程中可以保持两种不同的脑区特异性。为了进一步研究hSTOs中SpV和丘脑细胞之间的联系，研究人员使用rAAV2-retro变异体进行逆行示踪，发现将rAAV2-retro-hSyn-EGFP载体微量注射到丘脑区可以很容易地示踪hmSpVO侧的细胞；逆行标记的GFP⁺ hmSpVO细胞主要表达神经元标志物MAP2，但不表达星形胶质细胞标志物GFAP；投射到hThO的神经元主要是vGLUT2⁺ ExN，而不是PAX2⁺ InN。此外，逆行示踪还示踪了hThOs内融合的hmSpVO衍生的mCherry⁺轴突通路。研究人员还发现与hmSpVO-hThO示踪相比，hThO-to-hmSpVO示踪产生的GFP⁺细胞数量显著较高。为了进一步了解hmSpVOs和hThOs中的神经元是否建立了轴突投射，研究人员将AAV1-hSyn-ChrimsonR-tdTomato微量注射到hSTOs的SpV侧，然后对hSTOs的丘脑侧进行光遗传学和钙成像。发现应用561nm光可引起hThOs丘脑神经元的钙反应（图4）。综上所述，通过融合hmSpVO和hThO，可以在体外重现人SpV和丘脑之间的三叉神经-丘脑连接。

图4 hSTOs模拟了SpV和丘脑之间的连接

该研究显示，具有核特异性特征的脑类器官可用于在培养皿中重现人类脑-核相关的神经回路。hmSpVO和hThO的偏倚关系提示了三叉神经丘脑束发育过程中潜在的内在调控机制，值得进一步研究。总体而言，研究人员预见到一个利用精确引导的核特异性人脑类器官来模拟人脑核和相关神经回路的宝贵机会。

参考文献

Pang, W., et al., Generation of human region-specific brain organoids with medullary spinal trigeminal nuclei. Cell Stem Cell, 2024. Doi: 10.1016/j.stem.2024.08.004.