黑色素瘤中枢神经系统转移免疫微环境差异-1

文章概述

文章标题：《Single-Cell Characterization of the Immune Microenvironment of Melanoma Brain and Leptomeningeal Metastases》

发表日期和杂志：2021年发表在Clinical Cancer Research上

在线阅读链接：https:///10.1158/1078-0432.ccr-21-1694

研究目的：

黑色素瘤脑转移（MBM）和脑膜转移（LMM）是黑色素瘤中枢神经系统（CNS）转移的两种不同表现。研究使用单细胞RNA测序（scRNA-Seq）来定义MBM、LMM和黑色素瘤皮肤转移的免疫景观。

关键词简介

黑色素瘤

黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤，黑色素细胞主要负责产生黑色素——一种给皮肤、头发和眼睛提供颜色的蛋白质。

类型：

皮肤黑色素瘤：最常见的类型，发生在皮肤上的黑色素细胞中。
非皮肤黑色素瘤：包括发生在眼睛（如葡萄膜黑色素瘤）和粘膜（如肛门、口咽、鼻窦和阴道）的黑色素瘤。

风险因素：

紫外线（UV）辐射：尤其是来自太阳的紫外线，是黑色素瘤的主要风险因素。
皮肤类型：白人比有色人种有更高的发病率。
痣：大量痣或发育异常的痣（发育不良痣）可能增加风险。
家族史：有黑色素瘤家族史的人风险更高。
免疫系统受损：免疫系统功能低下的人更容易发生黑色素瘤。

症状和体征：

皮肤上的新痣或现有痣的外观变化，如不对称、边缘不规则、颜色不均、直径增大。
皮肤上的黑色或非常暗的斑点，尤其是快速增长的斑点。
不愈合的溃疡或痣上的出血。

分期：

黑色素瘤分为四个阶段（0期至IV期），分期基于肿瘤的厚度、是否侵入淋巴结或远处器官。

预后：

早期诊断和治疗的黑色素瘤患者预后较好。晚期黑色素瘤，特别是已经转移到身体其他部位的黑色素瘤，治疗难度大，预后较差。

黑色素瘤脑转移（MBM）

发病率：黑色素瘤是导致脑转移的第三大常见恶性肿瘤，大约60%的黑色素瘤患者会发生脑转移。在IV期黑色素瘤中，约30%的患者有脑转移，34%的患者在治疗过程中发生脑转移，90%的患者尸检可发现脑转移。
预后：MBM患者的预后普遍不佳，中位总生存期（OS）很少超过6个月。脑转移患者的中位生存期为4个月，脑转移占黑色素瘤患者死亡原因的25%-50%。
临床表现：MBM的临床表现与肿瘤累及部位有关，包括颅内压增高及特异的局限性症状和体征，如精神症状、癫痫发作、感觉障碍、运动障碍、失语症、视力下降、视野缺损等。

黑色素瘤脑膜转移（LMM）是黑色素瘤中枢神经系统转移的一种形式

定义与发生：

LMM是黑色素瘤细胞转移到脑膜的一种情况，通常表现为游离肿瘤细胞随脑脊液循环或黏附于软脑膜定植生长。

治疗难度与预后：

LMM治疗难度大，预后极差，常伴随脑实质转移。临床上观察到的脑膜转移影像学类型可分为4型，其中第4型患者常伴有较明显的中枢神经症状。

生物学特性与分子机制：

HMGA2基因在LMM中表达上调，与细胞迁移和增殖相关，可能通过调节HMGA2基因的表达来抑制LMM细胞的迁移和增殖。
LMM细胞具有相对独特的细胞特性，通过上调HMGA2基因表达促进细胞迁移和增殖。

研究意义：

构建中枢神经系统转移模型，探究LMM的特性，对抑制黑色素瘤脑膜转移，延长患者的生存期具有极其重要的意义。

单细胞数据详情

数据链接是：https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=GSE174401

样本来源：对26名个体的43个临床黑色素瘤样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-Seq）分析，这些样本来自三个不同的转移部位：皮肤、大脑和脑膜/CSF

8个皮肤转移的活检样本，这些样本来自参与I期临床试验（NCT02721459）的黑色素瘤患者，试验药物为vemurafenib-cobimetinib-XL888（包括2名患者的5个连续样本）。
14个脑转移切除手术样本，来自黑色素瘤患者（包括1名患者的2个连续样本）。
19个连续的脑脊液（CSF）样本，来自6名LMM（脑膜转移）患者。
作为对照组，还包括了2名非黑色素瘤患者且无LMM的CSF样本。

单细胞样品详情：

单细胞数据详情：

GSE174401.mapping.txt.gz 233 b
GSE174401_filtered_feature_bc_matrix.h5 71.9 Mb

提供了filtered_feature_bc_matrix.h5格式的文件，然后还是使用Read10X_h5函数读取，再进行整理就好,但是分组信息可能需要进行整理。

sce.all=CreateSeuratObject(counts =  
                             Read10X_h5('GSE174401_filtered_feature_bc_matrix.h5')
)

sce.all
as.data.frame(sce.all@assays$RNA$counts[1:10, 1:2])
library(stringr)
p=str_split(rownames(sce.all@meta.data),'-',simplify = T)[,2]
table(p)
sce.all@meta.data$orig.ident=paste0('p',p)
head(sce.all@meta.data, 10)
table(sce.all@meta.data$orig.ident)  
head(sce.all@meta.data)

单细胞分析流程

在质量控制和细胞分型的过程中，团队使用了R包Seurat来处理从10X Cell Ranger管道生成的31,075个细胞转录计数矩阵。

数据处理：

从总计31,075个细胞中筛选出2,367个细胞，这些细胞的线粒体读取比例超过20%，以确保数据质量。

两阶段聚类：

第一阶段用于广泛的细胞类型识别，第二阶段用于细胞亚群体的识别。
使用SCTransform中的正则化负二项回归和线性回归来调整细胞间的技术变异。

聚类算法：

在主成分分析（PCA）空间中使用无监督聚类算法Louvain来识别通过质量控制的细胞组。
结合R包SingleR生成每个细胞的细胞类型候选，使用多个参考面板进行比较。

细胞群体分类：

根据SingleR的预测结果，将每个细胞组分配到广泛的细胞类别，主要使用BlueprintEncode面板和文献回顾。
检测到四个样本中存在免疫球蛋白转录本的环境污染，为了消除这些污染的影响，除了SingleR外，重复进行了整个分析，将这些基因的表达水平在未分类为pDC、B或浆细胞的细胞中置为零。

次级聚类和细胞亚群体注释：

进行了第二阶段的聚类和整理，以分别映射出髓系、淋巴系和神经细胞群体的亚结构。
髓系细胞分析包括所有属于pDC和巨噬细胞/单核细胞/DC的细胞，而淋巴细胞分析则包括所有T/NK细胞。

数据验证：

为了验证，加载了来自Tirosh等人先前发布的19名黑色素瘤患者的4,645个细胞的scRNA-Seq数据，执行了上述质量控制和两阶段聚类，以识别广泛的细胞类型和详细的髓系及淋巴细胞亚群体。

主要分析结果

黑色素瘤样本中不同细胞类型的多样性和组成

ISCVA工具和架构

ISCVA是一个具有两阶段架构的分析工具。

第一阶段：处理scRNA-Seq数据。

第二阶段：允许在UMAP和t-SNE（t-distributed stochastic neighbor embedding）投影中交互式选择和可视化细胞亚群和基因。

黑色素瘤样本由恶性和宿主细胞类型的多样化组成

使用Louvain无监督聚类算法在PCA空间中识别通过质量控制的细胞群体。
根据SingleR预测（使用BlueprintEncode面板）和文献手动整理，为细胞群体分配广泛的细胞类别。
共识别出10种广泛的细胞类型，包括黑色素瘤细胞、巨噬细胞/单核细胞/树突状细胞（DCs）、T/NK细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）、成纤维细胞、B细胞、浆细胞、神经元、内皮细胞和其他细胞。
对所有43个样本的分析显示，黑色素瘤细胞是最多样化的细胞群，个体患者的细胞形成了自己独特的簇，而来自不同患者的基质细胞和免疫细胞亚型往往聚集在一起

每个位点的细胞类型组成的分析也揭示了TME组成的明显差异

LMM样本中的细胞富含T/NK细胞，并且具有最高比例的髓系/单核细胞。
脑转移样本倾向于每个样本中黑色素瘤细胞比例最高，T/NK细胞数量较低，并且存在浆细胞、B细胞和神经元（以及其他神经元细胞）。
皮肤转移样本经常含有成纤维细胞和数量最多的B细胞。

在个体样本水平上，细胞组成显示出相当的变异性。当有来自个体患者的连续样本时，TME组成会随着治疗和疾病进展而变化。

文章分析内容较多，咱们这期先了解一下黑色素瘤相关的背景知识，以及黑色素瘤样本中不同细胞类型的多样性和组成内容。下期再了解其余的分析！

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