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足细胞结构与功能
足细胞是位于肾小球基底膜外侧的脏层上皮细胞，由胞体、初级突起、次级突起和足突组成。相邻足突之间的裂隙覆有裂孔膜，为足细胞特有的细胞间连接，对肾小球选择性滤过起关键作用。
图1. 扫描电镜：1.胞体，2.初级突起，3.次级突起，4.足突。
图2. 透射电镜：FP.足突，足突与足突之间是裂隙覆有裂孔膜（红色箭头）。
足细胞有多种裂孔膜蛋白，包括Nephrin、Podocin、TRPC6、CD2相关蛋白、α-肌动蛋白-4等，这些蛋白质分子相互插入构成了肾小球滤过屏障的分子筛，是防止中、大分子量蛋白质漏出的重要分子屏障。裂孔膜蛋白的功能障碍和细胞骨架紊乱可导致裂孔膜的破裂和蛋白尿的形成。
图3. 足细胞足突内的大分子核心。
图4. 裂孔膜蛋白复合物的示意图。
Nephrin结构与功能
Nephrin是裂孔膜的重要结构成分，是一种特殊的肾小球粘附蛋白，在足细胞成熟并开始分化和形成突起时表达。除了其结构上的作用外，Nephrin还参与足细胞信号传导。Nephrin属于免疫球蛋白超家族，由8个细胞外免疫球蛋白样元件、一个纤维连接蛋白III型样结构域和一个细胞质C末端尾部组成。Nephrin是一种单通道跨膜蛋白，与细胞内外的其他Nephrin蛋白（反式和顺式）相互作用。
1998年首次发现的芬兰型常染色体隐性遗传性肾病综合征与NPHS1基因突变引起的Nephrin异常有关。单基因突变是足细胞足突和裂孔膜发育失败的原因，子宫内存在大量蛋白尿。患有这种疾病的儿童出生时患有肾病。大多数NPHS1突变发生在细胞外结构域，其中一个记录在细胞质结构域，只有少数发生在纤维连接蛋白结构域。
Nephrin缺乏症的小鼠模型清楚地显示了足突的异常，而初级突起和次级突起的变化很小。这些变化包括足突缩短、正常极性丧失和细胞间连接形成异常。这些异常与正常足突形态发生的变化有关，这是由于缺乏控制足细胞形态和过滤完整性的Nephrin信号复合体引起的。由于发育中的新生小鼠肾脏中Nephrin细胞质结构域中酪氨酸磷酸化的短暂出现，这种信号传导过程被认为是磷酸化介导的，这在成年小鼠中不再明显。这些磷酸化的酪氨酸能够与SH2结构域结合，从而与Nck相互作用，导致肌动蛋白丝的成核和聚合。一旦成熟的细胞间连接形成，磷酸化停止，Nephrin信号停止，证实了足细胞细胞间连接相关蛋白和肌动蛋白细胞骨架动力学之间的功能关系。
在足细胞损伤的情况下（例如，鱼精蛋白硫酸盐暴露），Nephrin也会变成酪氨酸磷酸化，使足细胞足突在一定程度上重塑其肌动蛋白结构。虽然已知肾小球损伤中酪氨酸磷酸化上调，但除Src激酶外，可能涉及的其他酪氨酸激酶的身份尚不清楚。
Nephrin信号事件影响细胞膜上肌动蛋白聚合复合物的组装和调节的过程也尚不清楚。它们已在模拟信号系统中进行了研究，在该系统中，CD16细胞外结构域和CD7跨膜结构域与酪氨酸激酶结合附着在Nephrin细胞质结构域上，该模型能够使用抗CD16抗体培育CD16簇和磷酸化。Nephrin-NEPH1复合物的激活足以诱导肌动蛋白聚合，共聚焦显微镜下可见聚集的CD16 Nephrin下方的肌动蛋白尾部，以及招募经典肌动蛋白成核分子Nck和Src激酶。
Nephrin磷酸化被认为通过调节板状伪足的形成在肌动蛋白动力学中起着进一步的作用，利用其组装蛋白质复合物的能力，这些复合物可以将肌动蛋白结合在一起，形成类似于板状伪足的宽三维结构。体外实验表明，可以使用SHIP2、丝蛋白和板状伪足等蛋白质交联肌动蛋白单体，这些蛋白质由Nephrin募集和调节。
抗Nephrin抗体
与具有既定遗传基础的先天性肾病综合征相比，儿童和成人非先天性肾病综合征的病因在很大程度上仍然未知。有强有力的证据支持免疫失调与潜在的致病循环因子有关；然而，它的身份仍然难以捉摸。糖皮质激素能有效诱导缓解；然而，复发、糖皮质激素依赖和不耐受常见，通常需要替代的免疫抑制剂。对于那些进展为终末期肾病（ESKD）并需要肾移植的糖皮质激素依赖性肾病综合征患者，该疾病在同种异体移植物中会迅速复发，这是一种灾难性且难以治疗的并发症。
最近发现，抗CD20-B细胞靶向治疗对经常复发或糖皮质激素依赖性肾病综合征的儿童和成人有效，这表明存在潜在的自身抗体介导的病因。然而，这种可能性很难与肾活检中微小病变性肾小球病（minimal change disease， MCD）缺乏IgG沉积的传统观点相一致。尽管MCD中描述了弥漫性足细胞相关IgG，但与膜性肾病相比，其含量很低，并且由于电子显微镜下没有电子致密沉积物，因此通常认为这是由于非特异性蛋白质吸收，意义不大。
在动物模型中注射Nephrin抗体，以及在CNF和完全性Nephrin缺乏的儿童肾移植后作为同种异体抗体出现时，针对裂孔膜成分Nephrin的抗体已被证明会引起大量蛋白尿。在动物模型和培养的足细胞中，抗Nephrin抗体引起Nephrin的重新分布，这与肾病综合征患者肾活检中观察到的结果相同。有人提出，Nephrin从裂孔膜的重新分布以及相邻足细胞之间细胞间连接的分离可以解释这些患者的蛋白尿；然而，这种再分配的原因仍然未知。
2022年，Watts AJB等发现，对活动性疾病期间获得的最早血清样本（UPCR＞3g/g）的评估显示，62名MCD患者中有18名（29%）（成人和儿童人数相同）对Nephrin自身抗体呈阳性。在18名抗Nephrin抗体阳性患者中，有12名在完全缓解（UPCR＜0.3g/g）或部分缓解（蛋白尿减少＞50%）期间提供了后续血清样本，观察到这些患者的Nephrin自身抗体完全缺失或显著减少。
图5. IgG阳性MCD（MCD7 ）的常规临床免疫荧光显微镜、PAS染色光学显微镜和电子显微镜（EM）图像。顶行：FITC-偶联IgG抗体可见弥漫点状染色，白蛋白染色未见。注意近端小管重吸收液滴中白蛋白染色呈阳性。中行：IgG亚型的染色证实点状染色没有限制，在这种情况下，与IgG3和IgG4亚型相比，观察到IgG1和IgG2的免疫反应性更强。底行：Kappa和Lambda轻链染色显示强度相等，外观与IgG染色相似。PAS染色显示轻微的光镜变化，EM显示弥漫性足突消失。
图6. MCD肾活检亚组中存在的点状IgG与关键的足细胞裂孔膜蛋白Nephrin共定位。
抗Nephrin抗体与足细胞病
抗Nephrin自身抗体的检测已被证明具有挑战性。直接蛋白印迹等传统方法可有效鉴定膜性肾病患者的自身抗体，但在鉴定抗Nephrin抗体方面效果不佳，可能是因为这些自身抗体的丰度或亲和力较低；因此需要高灵敏度的测定。Hengel FE等开发了抗Nephrin抗体定性和定量检测方法，定量检测方法可以通过为复发性pFSGS患者提供非侵入性诊断替代方案、加强治疗评估和改进肾移植策略，从而有可能改变肾病综合征的管理。
2024年，Hengel FE等研究发现，105名MCD成人患者中有46名（44%）血清抗Nephrin自身抗体阳性，74名pFSGS成人患者中有7名（9%）血清抗Nephrin自身抗体阳性；而182名特发性肾病综合征的儿童患者中，94名（52%）血清抗Nephrin自身抗体阳性。在未接受免疫抑制剂治疗的活动性MCD或特发性肾病综合征患者亚组中，抗Nephrin自身抗体的阳性率分别高达69%和90%。而在IgAN、ANCA-GN、LN和健康对照组的血清中未检测到抗Nephrin自身抗体。
图7. 伴有蛋白尿的肾小球疾病患者和对照组中抗Nephrin自身抗体的阳性率。
在纳入研究和随访期间，抗Nephrin自身抗体水平与疾病活动性相关。
图8. 抗Nephrin自身抗体与缓解和复发的纵向病程的相关性。A热图，显示了在纳入研究和随访期间，患有MCD或pFSGS的成年患者的抗Nephrin抗体状态（每个方格的上半部分）和尿ACR或PCR（每个方块的下半部分），这些患者在至少一个血清样本中抗Nephrin自身抗体呈阳性。患者2、12、15、16和18患有pFSGS；其他患者患有MCD。每一行代表一名患者，每一列代表一个随访时间点。右侧的数字表示以月为单位的总随访时间。B热图，显示了至少一个血清样本中抗Nephrin自身抗体阳性的特发性肾病综合征儿童在纳入研究和随访期间的抗Nephrin抗体状态和尿PCR。
图9. 显示了一名抗Nephrin相关MCD患者（患者1）的纵向病程。
图10. 显示了两名患者，一名患有抗Nephrin相关MCD（患者A，左），另一名患有与抗Nephrin相关的pFSGS（患者B，右），由于疾病复发期间抗Nephrin自身抗体阳性，他们前瞻性地接受了利妥昔单抗治疗。
疾病活动与检测抗Nephrin自身抗体之间的强相关性，以及这些自身抗体在肾小球疾病中的特异性，表明这些抗体不仅是足细胞损伤的副产物，而且在疾病的病理生物学特征中起着因果作用。在用Nephrin免疫的小鼠中，抗Nephrin自身抗体和肾病综合征的发展也说明了抗Nephrin自身抗体的致病性。与膜性肾病的免疫模型相比，Nephrin免疫的小鼠模型中的疾病是由单次免疫引发的，并在低抗体浓度下迅速表现出来。此外，Hengel FE等发现抗Nephrin自身抗体诱导Nephrin在Y1191处酪氨酸的磷酸化，这是介导Nephrin内吞作用和维持足细胞细胞骨架完整性的关键过程，这导致肌动蛋白和细胞骨架发生深刻改变。Hengel FE等的研究结果表明，这是一种新型的抗体介导的肾脏疾病，其中低水平的自身抗体，如针对Nephrin的抗体，会破坏肾功能，而不会引发传统的免疫反应。
抗Nephrin抗体与肾移植
目前的研究表明，移植前抗Nephrin抗体阳性（在移植前、中位4天获得）与疾病复发的风险较高有关（风险比，4.9；P<0.001）。2024年，Batal I等研究发现，移植前抗Nephrin抗体预测复发性弥漫性足细胞病的特异性为100%，敏感性为38%。
图11. 根据移植前循环抗Nephrin抗体（Abs）的阳性（Pos）与阴性（Neg）进行分层的患者的弥漫性足细胞病无复发同种异体移植物存活率。
综上所述，抗Nephrin的抗体的发现，有助于提高我们对MCD和FSGS的理解、分类和治疗，以及肾移植患者的管理。也许在不久的将来，抗Nephrin抗体之MCD/pFSGS的价值会如同抗PLA2R抗体之膜性肾病的价值。
1.Blaine J, et al. Cells . 2020 Jul 16;9(7):1700.
2.Benzing T, et al. N Engl J Med . 2021 Apr 15;384(15):1437-1446.
3.Garg P. Am J Nephrol . 2018:47 Suppl 1:3-13.
4.Watts AJB, et al. J Am Soc Nephrol . 2022 Jan;33(1):238-252.
5.Hengel FE, et al. N Engl J Med . 2024 Aug 1;391(5):422-433.
6.Batal I, et al. Kidney Int . 2024 Aug 9:S0085-2538(24)00546-5.
END
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