作者：盖洪伟，南京农业大学博士在读，主要研究根际微生物与植物的互作效应
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！ 本期周刊为您介绍利用合成生物学策略，构建具有多糖结合能力的工程菌作为“桥梁”，显著提升外源固氮菌在豆科植物根系的定殖效率，并最终实现重塑根际微生物组与提升作物产量的机制。原文于2025年发表在 Microbiome 上。
固氮细菌(NFBs) 在生物固氮中发挥着关键作用，为农业和自然生态系统中的植物提供必需的氮素营养。尤其是它们与豆科植物形成的互惠共生体系，在促进植株发育和改良地力方面具有不可替代的作用。尽管外源接种NFBs 被视为增产增肥的理想手段，但在实际应用中，其固氮潜力往往受制于其微弱的根际竞争能力与极低的有效定殖率。为此，本研究基于合成生物学策略，构建了一种具有人工多糖识别能力的工程菌—EcCMC。通过在典型豆科植物（紫云英与紫花苜蓿）中的验证，证实了EcCMC 能够充当“物理桥梁”，介导外源固氮菌在根表的精准招募与稳固成膜，提高定殖率。扩增子测序与根际代谢组学解析进一步揭示了EcCMC对根际微生物组的深刻重塑，促使根瘤菌目和鞘脂单胞菌目等核心固氮菌群的相对丰度显著上调，并显著提高固氮酶活性、土壤全氮与有机质含量最终大幅提升作物产量。该研究不仅为利用合成生物学辅助调控豆科植物根际微生物组、以增强固氮作用和提高土壤肥力提供了新的见解。所设计的多糖结合蛋白未来有望作为一种通用工具，用于促进植物生长并增强作物的抗逆性。
1.外源固氮菌（NFBs）无法在根际土壤中实现高效定殖
研究首先向紫云英根际接种了外源固氮菌（苜蓿中华根瘤菌NKN632与内生鞘脂单胞菌NKN643，从野豌豆根际土壤中分离得到），以探究外源固氮细菌的促生效果（图S1）。结果表明，尽管接种了外源固氮菌（NKN632，NKN643以及二者联合接种NFBs），但在14 至28天后，其根际固氮菌数量便与对照组无异（图S1a），未能实现有效定殖。由于缺乏持续的定殖能力，接种后土壤的固氮酶活性与全氮含量仅有微弱提升（图S1b，S1c），对植物鲜重的实际贡献小（图S1d）。这一结果表明，单纯的菌剂接种难以在复杂的根际环境中竞争并维持活性。为此，研究团队引入合成生物学技术，旨在通过强化“根-菌”物理绑定来改善定殖，从而真正提升生物固氮效率与作物产量。
图S1 接种固氮菌(NFB)对根际土壤中固氮细菌数量(a)、固氮酶活性(b)、全氮(TN, c)以及植物鲜重(FW, d)的影响
2.合成细菌EcCMC 能够强烈结合表面暴露多糖的固氮细菌
此前研究证实，多糖结合型工程菌EcCMC 具有极高的环境安全性，接种14 天后即可代谢消失，生态风险极低。为破解固氮菌（NFBs）定殖难题，研究团队利用激光共聚焦显微成像技术构建了精细的验证体系：首先利用DAPI（蓝色荧光）标记细菌菌体，并引入特异性结合多糖的探针FITC-ConA（呈现绿色荧光）。实验观察发现，固氮菌NKN632 和NKN643 表面覆盖有显著的多糖层（图S2a, 图S3），而作为对照的桃树根际分离菌株（NK1431和NK531）由于不产胞外多糖，未检测到绿色荧光信号。随后，研究引入了带有 红色荧光 且表面展示多糖识别蛋白的工程菌EcCMC。实验对比发现，仅具备红色荧光但缺乏识别能力的对照菌EcM 无法有效结合目标菌，而 EcCMC 则能精准锁定固氮菌表面的绿色多糖信号（图S2c），两者的共定位系数（PCC）高达0.87（图S2d）。最终，EcCMC 通过这种高亲和力的绑定作用，成功诱导原本分散的固氮菌发生剧烈的物理聚集（图S2e）。这一“物理桥梁”机制的确证，为通过合成生物学手段克服根际定殖瓶颈、提升生物固氮效率奠定了核心实验基础。
图S2 合成细菌EcCMC 对表面暴露多糖的固氮细菌（NFBs）具有极强的结合能力
图S3 NKN632、NKN643 以及对照组脱氮阿氏菌NK531 经FITC-ConA 染色后的激光共聚焦图像
3.EcCMC 提高了外源固氮细菌（NFBs）在根部的招募与定殖能力
研究表明，合成细菌EcCMC 虽然源自大肠杆菌，但其具备通过表面展示的多糖结合蛋白将功能菌募集在植物根系的能力。实验证实，EcCMC 在接种14 天后便不可检测，说明其促生作用仅依赖于初期的物理绑定而非种群的持续增殖（图1）。为验证其在豆科植物上的应用，研究团队在紫云英根部开展了定殖实验。荧光成像分析显示，在对照组（NFBs + EcM）中，根部几乎观察不到细菌附着；而在实验组（NFBs + EcCMC）中，代表NFB 的蓝色荧光与代表EcCMC 的红色荧光在绿色根系表面高度重叠，表明固氮菌被高效招募至根表（图1a）。显微观察进一步发现，NFBs 在根部形成了致密的生物膜层，而非散乱的个体分布（图1a）。定量检测证实，在EcCMC 的辅助下，固氮菌的根系结合率从不足20% 显著提升至 90% 以上（图1b）。通过扫描电镜（SEM）观察，EcCMC 处理组的根系表面聚集了大量的细菌细胞，其数量远超对照组和EcM 处理组（图1c）。共培养48 小时的CFU 检测结果一致表明，EcCMC 通过增强物理绑定显著提高了外源固氮菌在宿主根部的招募能力与定殖水平（图1d）。
图1 EcCMC 辅助固氮细菌（NFBs）在紫云英根部的招募与定殖
4.EcCMC 与外源固氮细菌（NFBs）显著重塑了根际微生物组
通过细菌16S rDNA与真菌ITS测序分析发现，NFBs + EcCMC处理显著重塑了紫云英的根际微生物组。在多样性方面，该处理显著提升了根际真菌的Simpson 指数（图2a），其中与固氮相关的格孢菌目（Pleosporales）丰度大幅增长了1.87 倍（图2f），这归因于EcCMC 对真菌多糖的高效吸附作用。在细菌群落层面，该处理显著提高了根瘤菌目（Rhizobiales）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）和黄单胞菌目（Xanthomonadales）的相对丰度，增幅分别达0.494、0.345 和0.676 倍（图2b）。由于生物膜是细菌在根际稳定生存的核心，结果证实NFBs + EcCMC 组中具备成膜能力的细菌丰度显著最高（图2c），且上述三大关键促生菌目在生物膜功能组分中均达到峰值（图2d）。机制分析表明，黄单胞菌目负责早期定殖，而EcCMC 作为“物理桥梁”进一步招募了大量如根瘤菌目等促生菌（PGPR）在根表集结，最终使固氮菌的定殖数量（CFU）达到最高（图2e），从生态与物理层面共同优化了根际微环境。
图2 在EcM或EcCMC辅助下，接种固氮细菌 (NFBs) 培养28天后对紫云英根际微生物组的重塑 (n = 3)
5.EcCMC 与外源固氮细菌（NFBs）对紫云英根际代谢的影响
研究团队对对照组、NFBs + EcCMC 组和NFBs + EcM 组进行了根际代谢组学分析。结果表明，主成分分析（PCA）显示处理组间差异显著，特别是对照组与NFBs + EcCMC 组的代谢谱完全分离（图3a），而与NFBs + EcM 组差异相对较小（图3b）。火山图分析显示，NFBs + EcCMC 组较对照组显著增加了438 种代谢物，包括婆罗门参皂苷B、阿维菌素B1a、金盏花黄质、去氧甘草内酯及菜蓟皂苷F 等（图3c），且较NFBs + EcM 组也增加了82 种代谢物（图3d）。KEGG 通路富集进一步揭示，NFBs + EcCMC与对照组在alpha-亚麻酸代谢、组氨酸代谢、嘌呤代谢等6条通路上差异显著（图3e）；而与NFBs + EcM 组相比，差异主要集中在角质、木栓质和蜡质生物合成、硫代谢及cAMP 信号通路等8条代谢途径（图3f）。综上所述，这些结果确证了NFBs联合EcCMC对紫云英根际代谢产生了深远影响，这种代谢重塑很可能与根际微生物组的优化密切相关。
图3 在EcM (NFBs + EcM) 或 EcCMC (NFBs + EcCMC) 辅助下接种固氮细菌处理28天后，紫云英根际土壤的代谢组学分析
6.EcCMC 与外源固氮细菌（NFBs）促进了土壤肥力及紫云英的生长
研究表明，NFBs + EcCMC 联合接种显著提升了根际土壤的肥力与健康水平。该组的固氮酶活性、全氮及有机质含量均远超对照组，这主要归因于EcCMC 诱导的根瘤菌目丰度及固氮菌数量的增加。同时，根际土壤的脲酶、酸性磷酸酶及过氧化氢酶活性显著增强，为植物生长创造了优越的微环境。组织学观察与表型数据进一步证实，NFBs + EcCMC处理下的根系细胞结构更完整（图4a），根系显著增长且增粗（图4b, c），干物质中的氮、磷、钾养分含量也达到了最高水平（图4d）。这一系列结果确证了合成细菌EcCMC 在重塑根际环境、提升土壤肥力及促进紫云英生长方面的核心价值。
图4 在EcM (NFBs + EcM)或EcCMC (NFBs + EcCMC)辅助下接种固氮菌培养28天后，紫云英根系的特征
随后，研究团队对叶片代谢及生长指标进行了测定。结果显示，培养14 天后，NFBs + EcCMC组展现出显著的生长优势。与NFBs + EcM对照组相比，其株高（17.6 cm）、鲜重（2.46 g）及叶面积（34 cm2）的提升幅度均超过了36%（图5a-c）。生理检测进一步证实，该处理组的叶绿素a与b含量均达到峰值（图5d）；同时，其干叶中的氮（约3%）、磷（0.286%）、钾（1.557%）养分含量以及可溶性蛋白（32.5 mg/g FW）较空白对照组（Control）与NFBs + EcM 组均有显著突破（图5e, f）。此外，显微观察显示该组叶片表面具有更致密的突起结构（图5g）。综上所述，合成细菌EcCMC通过介导固氮菌的高效定殖，显著促进了紫云英植株及叶片的整体生长发育，其效果远超单纯接种外源固氮菌。
图5 在EcM (NFBs + EcM)或EcCMC (NFBs + EcCMC)辅助下接种固氮细菌培养28天后，紫云英的植物生长及叶片代谢分析
7.EcCMC与外源固氮细菌（NFBs）促进紫花苜蓿的生长
研究进一步在紫花苜蓿上验证了该策略的普适性。显微观察证实，在EcCMC辅助下，固氮菌成功在苜蓿根表大量定殖（图S11a, b）。根际微生物分析显示，该处理显著提升了根瘤菌目、鞘脂单胞菌目及格孢菌目等关键菌群的丰度（图6a, b），并使固氮菌数量达到最高（图6c）。受益于益生菌群的富集，根际固氮酶活性、全氮及有机质含量较对照组显著提升，增幅分别超过25.9%、52.9% 和16.4%（图6d-f）。最终，培养14 天后的紫花苜蓿长势显著增强，其株高与鲜重分别大幅提升了81.8% 和55.9%（图6g-i），且叶面突起结构更为致密（图6j）。结果确证NFBs + EcCMC 体系能有效重塑不同豆科作物的根际微环境并显著促进其生长。
图6 在EcM (NFBs+EcM)或EcCMC (NFBs+EcCMC)辅助下接种固氮菌培养28天后，对紫花苜蓿微生物组组成、固氮作用及植物生长的影响
图S11 EcCMC辅助固氮细菌（NFBs）在紫花苜蓿根系的招募与定殖
综上所述，本研究开发了一种合成细菌辅助外源固氮菌（NFBs）定殖的技术，用以增强豆科植物应用中的固氮能力和土壤肥力。得益于其多糖结合能力，合成细菌EcCMC能够充当“桥梁”，显著改善固氮菌在根系的定殖。由EcCMC 介导的根际微生物组重塑，进一步提升了土壤肥力并促进了植物生长。凭借合成细菌与固氮菌对绿肥作物的积极作用，本研究为基于工程菌调控根际微生物组以提高生物固氮效率和改善土壤肥力提供了一种创新策略。
论文信息
原名：Synthetic bacterium-facilitated colonization ofnitrogen-fxing bacteria for remodeling the rhizosphere microbiome and improving plant yield
译名：合成细菌促进固氮菌定殖、重塑根际微生物组并提升作物产量
期刊：Microbiome
DOI：10.1186/s40168-025-02189-5
发表时间：2025.11
通讯作者：喻其林
通讯作者单位：南开大学