大家好，今天跟大家分享一篇题为 Ubiquitin ation regulates ER-phagy and remodelling of endopl asmic reticulum（泛素调节内质网吞噬和重塑）内质网(ER)通过选择性自噬途径(ER-phagy)经历持续的重塑。ER自噬受体在这一过程中起核心作用，但其调控机制仍不清楚。
01
研究背景
内质网 （ER） 通过选择性自噬途径（称为 ER 自噬）经历连续重塑1.内质网自噬受体在此过程中起着核心作用2，但调节机制在很大程度上仍然未知。在这里，我们报道了 ER 自噬受体FAM134B在其网状同源结构域 （RHD） 内的泛素化促进受体聚集并与脂质化的 LC3B 结合，从而刺激 ER 自噬。
分子动力学 （MD） 模拟显示了泛素化如何扰乱模型双层中的 RHD 结构并增强膜曲率诱导。RHD 上的泛素分子介导相邻 RHD 之间的相互作用，形成致密的受体簇，促进脂质双层的大规模重塑。膜重塑在体外用脂质体和泛素化FAM134B重构。使用超分辨率显微镜，我们在细胞中发现了FAM134B纳米团簇和微团簇。
定量图像分析显示泛素介导的FAM134B寡聚化和簇大小的增加。我们发现，多聚体 ER 自噬受体簇中的 E3 连接酶 AMFR 催化泛素化并调节 FAM134B ER 自噬的动态通量。我们的结果表明，泛素化通过受体聚集增强 RHD 功能，促进 ER 自噬并控制 ER 重塑以响应细胞需求。
见图一
FAM134B RHD 的泛素化。
图一
a，用于分析用 Torin 1（6 小时，橙色）和 DMSO（基础，蓝色）处理后从细胞裂解物中分离的 GFP-FAM134B 共免疫沉淀物或模拟处理的细胞（GFP 空，浅蓝色）的 MS 工作流程。HF、Qexactive HF（超高场 Orbitrap）质谱仪;LFQ，无标记定量;3xR 3 个生物学重复。面板 a 部分使用 Servier Medical Art （Servier） 生成，根据 Creative Commons Attribution 3.0 未本地化版本许可获得许可。
b，在对照条件下对 250 nM Torin 1 反应 6 小时的 FAM134B泛素化。将 FAM134B 的 diGly 肽强度归一化为修饰和非修饰的 FAM134B 肽的总强度（数据是 ± s.d. 的平均值;n = 3 个独立实验，双向方差分析，Bonferroni 事后检验）。
c， FAM134B 的示意图组织。RHD 由两个由接头分隔的跨膜片段 （TM，绿色） 和两个保守的两亲性螺旋 （AH，黄色） 组成。突出显示了保守的赖氨酸残基（蓝色）和泛素化赖氨酸（红色）。
d，TUBE-2 pulldown 测定显示 Torin 1 处理后 FAM134B 的时间依赖性泛素化增加。WB， western blot。
e，泛素化 HA-FAM134B 免疫印迹信号的光密度定量，归一化为总 HA-FAM134B 水平 （d）。数据均为均值±标准差;n = 3 个独立实验;单因素方差分析，Bonferroni 事后检验。
f，FAM134B细胞中的 RHD 泛素化测定显示，当 17 个保守的赖氨酸残基被精氨酸取代时，泛素化减少（Myc-Ub 免疫沉淀 （IP））。缺乏 RHD 泛素化会降低与 LC3B-II 的结合和寡聚物质 （HA–FAM134B IP） 的丰度。IB，免疫印迹;exp.， 实验。
g，对来自 f（泳道 1 和 2）的免疫印迹信号进行光密度定量：LC3B-II 与 HA-FAM134B WT 或 HA-FAM134B 17KR 和寡聚体结合。数据均为均值±标准差;分别进行 n = 5 和 n = 3 个独立实验;单尾未配对学生 t 检验。
h，对用 250 nM Torin 1 处理 2 小时的细胞中与 LC3B 和 Ub 共标记的 HA-FAM134B 进行共聚焦荧光显微镜分析。箭头表示与 HA FAM134B（绿色）和泛素（红色）共定位的自噬体 （LC3B 阳性）。
见图二
Ub 在 RHD 结构和功能中的作用。
图二
a，MD 模拟中泛素化和非泛素化 FAM134B RHD 变体的平衡结构突出了 Ub 部分（青色和蓝色）相对于 RHD（绿色）和 POPC 双层（橙色珠子）的排列。
b，泛素化加速膜曲率诱导。K160-Ub（左）比非泛素化 RHD 诱导 bicelles 更快地转变为闭合囊泡（等待时间的累积分布函数 （CDF） 如右图所示;比较青色、蓝色和紫色与绿色）。
c，使用纯化蛋白质样品（GST-Ub、GST-RHD）的体外脂质体重塑实验90–264、GST–Ub–RHD90–264–Ub） 与脂质体在 25 °C 下孵育 8 小时。上图显示了代表性的负染色透射电子显微照片。通过使用 ImageJ （版本 1.51w） 测量其直径 （虚线） 来定量重塑的蛋白脂质体。底部面板显示了脂质体大小分布的小提琴图。小提琴图显示箱线图，其中包含中位数（黑点）、四分位距（黑色阴影区域）、最小值和最大值（1.5×四分位区域）和侧面的镜像概率密度估计值（彩色阴影区域）。GST-RHD 平均值 = 64.40 nm;GST–Ub–RHD90–264–Ub 平均值 = 39.10 nm;GST-Ub 平均值 = 127.47 nm。GST-RHD90–264 n = 625;GST–Ub–RHD90–264–Ub n = 961;GST–Ub n = 1,573;Kruskal-Wallis 或 Dunn 的事后检验。
d， Ub 促进受体聚集和膜重塑。快照显示了模拟结束时模型 POPC 双层（橙色）中 9 个 （K160 + K264）-Ub-RHD 分子的排列。通过改变双层不对称性 ΔN = 0 和 300 以及蛋白质-蛋白质相互作用强度 α = 1 和 0.65，在四种不同条件下进行 MD 模拟，如下图所示。
见图三
RHD 泛素化对 ER 自噬通量和 FAM134B 簇大小的影响。
图三
a，ER-噬态报告基因系统 mCherry-GFP-FAM134B。
b，表达 mCherry-GFP-FAM134B WT 或 mCherry-GFP-FAM134B 17KR 的 U2OS TRex 稳定细胞系。比例尺，10 μm。
c，ER-自噬通量被量化为 mCherryGFP 之间的比率+–和 mCherryGFP 点。n = 4 个独立实验，其中 mCherry-GFP-FAM134B WT 每个条件的细胞总数为：482 （基础 （DMSO））、738 （BafA1）、673 （EBSS）、842 （Torin 1） 和 667 （Torin 1 + BafA1）。mCherry-GFP-FAM134B 17KR 每个条件的细胞数：440 （DMSO）、864 （BafA1）、723 （EBSS）、968 （Torin 1）、535 （Torin 1 + BafA1）。数据均为均值±标准差;单因素方差分析，Bonferroni 事后检验。
d，HA-FAM134B的 DNA-PAINT 超分辨率图像。标示了微米级（红色）和纳米级（黄色）簇（红色）。比例尺，10 μm（左图）和 1 μm（右图;左图的放大区域）。
e， HA–FAM134B WT 和 HA–FAM134B 17KR 簇区的相对频率分布 （110 > n++簇< 251） 在基础条件下的 U2OS 细胞中鉴定 （nWT= 10 个单元格，n17 瑞典克朗= 8 个细胞）或接受 Torin 1 处理 （nWT= 11 个单元格，n17 瑞典克朗= 14 个单元格）。
f，HA-FAM134B WT 和 LC3B-II 纳米级簇（黄色虚线圆圈）的 DNA-PAINT 超分辨率成像。顶部面板中的白色虚线表示单元格轮廓。比例尺，10 μm（上面板）和 1 μm（下面板;顶部面板的放大区域）。
g， HA–FAM134B 和 HA–FAM134B 17KR 纳米尺度团簇直径的相对频率分布 （n细胞= 4， nWT 集群= 1,278;n17KR 集群= 1,255）。直方图拟合对数正态分布，后跟非参数单尾 Mann-Whitney U 检验。使用平均值和标准差 （HA–FAM134B 17KR： μ = 88nm， σ = 24 nm;HA–FAM134B WT：μ = 123 nm，σ = 46 nm）。h，纳米级簇中 FAM134B 拷贝数的定量分析。比例尺，1 μm。逆暗时间的相对频率分布 （τD） 记录了用 DNA-PAINT 记录的单分子结合时间间隔（右）。
见图四
含 FAM134B 的寡聚物的泛素化位点分析和蛋白质相互作用子。
图四
a，FAM134B 二聚体的双分子互补亲和纯化测定的示意图。将全长FAM134B融合到 Venus 荧光蛋白的两个非荧光互补片段 （V1-FAM134B 和 V2-FAM134B） 的 C 端。
b，对 V1-FAM134B 和 V2-FAM134B 之间相互作用产生的双分子荧光互补信号进行共聚焦荧光显微镜分析。表达 V1-FAM134B 和 V2-FAM134B 的固定细胞用抗 Ub（FK2）（红色）或抗 LC3B（灰色）染色。箭头表示 Venus 信号（绿色）、泛素（红色）和 LC3B（灰色）的三重共定位。比例尺，10 μm。
c，荧光强度分布的直方图分析显示，二聚体FAM134B共定位于 Ub 和 LC3B 囊泡中。
d，FAM134B同源二聚体的定量无标记相互作用组的单侧火山图，描绘了含有 RHD 的 ER 蛋白（蓝色）、自噬相关蛋白（绿色）和泛素化机制（红色）。数据表示三个独立实验，即单侧未配对的 Student t 检验。
e，比较 FAM134B WT 同源二聚体与 FAM134 17KR 同源二聚体与含 RHD 的 ER 蛋白、自噬相关蛋白和泛素化机制相互作用的热图。
见图五
AMFR 对 FAM134B RHD 泛素化和 ER 自噬的影响。
图五
a，用 siNT 或 siAMFR 转染 HeLa 细胞，并用 250 nM Torin 1 处理指定时间。通过 western blot 分析蛋白质提取物的 FAM134B、 AMFR 或黏着斑素。
b，a 中 FAM134B 的 western blot 信号的光密度定量（数据均为 ± s.d.;n = 3 个独立实验;双向方差分析，Bonferroni 事后检验）。
c， AMFR 敲低细胞中 SFB 标记FAM134B的泛素化。将 diGly 肽强度归一化为修饰和非修饰的 FAM134B 肽的总强度（数据是 ± s.d. 的平均值;n = 3 个独立实验;双向方差分析，Bonferroni 事后检验）。
d，用 siNT、靶向 AMFR 的 siRNA #1 或 siRNA #2 转染表达 mCherry-GFP-FAM134B WT 的 U2OS TRex 稳定细胞系。如图所示处理细胞。将 ER 自噬的通量量化为 mCherryGFP+–和 mCherryGFP 点。数据代表了三个独立实验，其中每个条件的细胞总数为：699 siNT/DMSO、683 siNT/BafA1、695 siNT/Torin 1、678 siNT/Torin 1 + BafA1、627 siAMFR #1/DMSO、668 siAMFR #1/BafA1、713 siAMFR #1/Torin 1、591 siAMFR #1/Torin 1 + BAfA1， 624 siAMFR #2/DMSO， 593 siAMFR #2/BafA1， 575 siAMFR #2/Torin 1 和 615 siAMFR #2/Torin 1 + BafA1。数据是均值 ± s.d.、单因素方差分析、Bonferroni 事后检验。
e，与非泛素化或泛素化 GST-FAM134B 一起孵育的冷冻断裂脂质体的直径。数据是平均 ± sem，归一化为 GST 对照的平均脂质体直径，代表三种独立的脂质体制备和实验（非 Ub 样品 n = 1,064，Ub 样品 n = 793，GST 对照 n = 434;Kruskal-Wallis/Dunn 的后测）。
f，E3 连接酶 AMFR 被募集到 ER 自噬受体簇以诱导 FAM134B泛素化的模型。该事件触发 ER 自噬受体簇的构象和组成的变化，使簇的大小增加，从而控制 ER 重塑和 ER 自噬。mATG8s，哺乳动物 ATG8 蛋白。
02
研究结论
总之，泛素化通过受体聚集增强RHD功能，促进ER吞噬并控制ER重塑以响应细胞需求。该发现有助于更好地了解内质网动力学缺陷在疾病发生发展中扮演的角色。
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