微精选

第一作者：孙兰超

通讯作者：李传海

通讯单位：青岛大学公共卫生学院

论文DOI：10.1021/acs.est.4c07215

图文摘要

成果简介

近日，青岛大学公共卫生学院李传海老师课题组在环境领域知名期刊Environmental Science
& Technology上发表了题为“Adipogenic effects of cresyl diphenyl phosphate (triphenyl phosphate
alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor gamma pathway: A comprehensive study integrating in vitro, in
vivo, and in silico from molecule to health risk”的研究论文，使用新的替代方法（NAMs），通过生物活性有效剂量将分子相互作用、信号通路、细胞功能、动物效应和人群风险的多层证据整合，探究了新型有机磷酸酯类化合物（OPE）磷酸甲苯二苯酯（CDP）和传统OPE磷酸三苯酯（TPHP）通过作用于过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的成脂效应及相关健康风险。

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磷酸甲苯二苯酯（CDP）是一种新型的有机磷酸酯（OPE），已在多种环境和人体样本中普遍检出。然而，对于其毒性、作用机制和潜在健康风险的了解非常有限。该研究从分子相互作用–信号通路–细胞功能–动物效应–人群健康多个层面系统的研究了CDP的潜在成脂效应，并创新性的应用受体结合浓度（Receptor-bound
concentration，RBC）这一生物最有效剂量进行了CDP和TPHP通过激活PPARγ的人群健康风险评估。

通过文献检索筛选出19种在人体内普遍检出的化合物，在这些化合物中，CDP对PPARγ的结合亲和力最高，其次是TPHP。受体激活和对接结果显示，CDP通过强大的疏水性和氢键相互作用于结合位点，从而激活PPARγ，且CDP的效能高于TPHP。在3T3-L1细胞中，CDP增强了PPARγ介导的成脂活性，其效能也优于TPHP。在HEK293细胞和3T3-L1细胞中，CDP的细胞内浓度和RBC均高于TPHP。在小鼠实验中，CDP的暴露激活了PPARγ介导的成脂途径，导致白色脂肪组织重量增加。定量体外–体内外推（QIVIVE）结果表明，在当前的暴露水平下，CDP激活PPARγ介导的成脂效应风险应引起高度关注。

总体而言，CDP能够结合并激活PPARγ，从而促进前脂肪细胞成脂分化和白色脂肪组织的堆积。CDP可能是一种新型的环境肥胖原，其效能可能超过TPHP，其潜在的肥胖风险应受到高度关注。

引言

有机磷酸酯（OPEs）常作为阻燃剂、增塑剂和添加剂广泛应用于工业和消费产品中，目前已经在环境和人体中鉴定出超过100种不同类型的OPEs。同时，发现多种OPEs可诱发多种健康危害，如发育和生殖毒性、内分泌干扰效应以及代谢相关毒性。磷酸甲苯二苯酯（CDP）是一种磷酸三苯酯（TPHP）的结构类似物，近年来作为TPHP的替代品广泛用于各种阻燃剂和添加剂中。2020年，中国CDP年产量达到了9,625吨，在多种环境基质和生物体中被广泛检测到。此外，多项研究已经表明，在人类血液样本中也发现了CDP，平均浓度为3.24 ng/mL。这些来自环境和人体监测报告的发现表明，CDP可能对生态系统和人类健康产生潜在影响。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是一种配体激活的转录因子，是脂肪生成的重要调节因子。之前的研究表明，TPHP是一种选择性PPARγ配体，可以促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的脂肪生成分化。动物研究表明产前暴露TPHP，可以增加子代肥胖的风险。鉴于CDP与TPHP具有相似的化学结构，基于结构相似效应相似的原理，我们推测CDP可能激活PPARγ诱导类似的脂肪生成效应，CDP是否可以作为TPHP的安全替代品仍然未知。

图文导读

OPEs与人源PPARγ-LBD的结合和活性

图1：OPEs与人源PPARγ-LBD的结合和活性。

为了探究OPEs与核受体PPARγ-LBD的亲和力、激动活性以及结合位点，首先通过竞争结合实验评估了19种在人体血样中常见的OPEs与人源PPARγ-LBD的结合能力（图1A和图1B）。结果显示，仅有CDP和TPHP的相对结合能力超过5%。利用双荧光素酶报告基因实验和分子对接实验分别探究了CDP和TPHP与人PPARγ-LBD转录激活效应以及发挥效应的结合位点（图1C和图1D），结果显示，CDP和TPHP以剂量依赖的方式增强了人类PPARγ介导的荧光素酶转录活性，激活能力CDP强于TPHP。同时分子对接表明CDP和TPHP都可以与ARG288（H3）和SER342（H5）形成氢键，此外，CDP还与CYS285（H3）形成氢键相互作用。CDP和TPHP与PPARγ的结合能分别为-8.61 kcal/mol和-8.54 kcal/mol。以上结果均表明，在分子水平上CDP和TPHP可以结合并激活核受体PPARγ。

CDP和TPHP对3T3-L1细胞成脂分化的影响

图2：CDP和TPHP在3T3-L1细胞中的脂肪生成活性。

在细胞水平上，进行了小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）的成脂分化实验，如图2A-C所示，CDP和TPHP以剂量依赖的方式促进了3T3-L1前脂肪细胞的分化，且CDP效应强于TPHP，同时在甘油三酯（TG）含量分析中得到了同样的结果（图2C）。后分析了脂肪生成相关基因，包括Pparg、脂肪酸结合蛋白4（Fabp4）、脂蛋白脂肪酶（Lpl）和脂联素（Adip）的mRNA表达水平，发现CDP和TPHP同样以剂量依赖的方式增加了这些基因的表达，LOEC范围分别为0.01-1 μM和0.01-10 μM（图2D）。和预期相同，在3T3-L1细胞中，CDP在相同浓度下经过10天暴露后，诱导的脂肪生成相关基因表达高于TPHP。

PPARγ在CDP和TPHP诱导的3T3-L1细胞成脂分化中的作用

图3：T0070907对CDP和TPHP诱导的3T3-L1细胞脂肪生成活性的拮抗作用。

为了确认PPARγ参与了CDP和TPHP诱导的3T3-L1前脂肪细胞脂肪生成效应，我们引入了一种特异性的PPARγ拮抗剂T0070907。当细胞与1 μM T0070907共同暴露时，CDP和TPHP诱导的脂质积累效应和脂肪生成相关基因表达显著抑制（图3）。进一步证实了CDP和TPHP是通过结合并激活PPARγ受体诱导3T3-L1成脂分化。

CDP和TPHP在HEK293细胞和3T3-L1细胞中的胞内剂量分析

图4：HEK293细胞和3T3-L1细胞中CDP和TPHP的内剂量。

化学物质在细胞内的浓度是其调节核受体活性及后续细胞反应活性的关键因素。我们测量了CDP和TPHP在HEK293细胞和3T3-L1细胞中的细胞内浓度，并进一步确定了细胞内PPARγ结合的CDP或TPHP的相对生物活性浓度（RBC）（图4）。发现CDP的胞内浓度与RBC在HEK293和3T3-L1细胞中均显著高于TPHP（图4）。

CDP在小鼠中的脂肪生成效应

图5：CDP在小鼠中的脂肪生成效应。

多项研究已证明TPHP在小鼠中的肥胖效应，但尚无研究报道CDP在小鼠中的增脂效应。因此，本研究仅对CDP在小鼠中的增脂效应进行了进一步研究，暴露时间为12周。中等和最高剂量组的CDP暴露后的腹部白色脂肪（WAT）重、CDP的生物蓄积和WAT细胞形态学改变均显著高于对照组（图5A-G）。此外，CDP还以剂量依赖方式提高了Pparg、Fabp4、Lpl和Adip的表达（图5H-K）。在0.1、1和10 mg/kg/day的CDP处理组中，WAT中PPARγ结合CDP的RBC分别为3.8×10^^-9、7.3×10^^-8和3.7×10^^-6nM/mg蛋白（图5D），这些数值与在3T3-L1细胞中观察到的RBC范围非常接近。表明CDP在小鼠体内存在着与体外实验相同的脂肪生成机制，进而引起脂质累积，导致肥胖。

CDP和TPHP通过PPARγ通路的脂肪生成风险评估

图6：CDP和TPHP通过PPARγ通路的脂肪生成风险。

最后，本研究整合了生物监测数据和通过PPARγ通路对脂肪生成影响的实验证据，全面评估与CDP和TPHP暴露相关的脂肪生成潜在健康风险。为此，我们开发了一种基于生物活性等效剂量（RBC）的定量体外–体内外推（QIVIVE）方法，该方法将体外实验数据与体内暴露水平联系起来，提供了更准确的评估CDP和TPHP通过PPARγ通路引发的脂肪生成风险（图6A）。结果显示，对于TPHP，48.3%的人群处于红色区域（应受到高度关注）。相比之下，CDP的MOE值范围为0.06到8.13，只有11.01%的人群处于高度关注的红色区域。虽然目前CDP的潜在致肥胖风险小于TPHP，但随着大量的CDP投入市场，其生物蓄积效应将会日益加重，其通过PPARγ介导的脂肪生成风险将不容忽视。

小结

总体而言，据我们所知，这是首个全面研究CDP肥胖效应的研究，涵盖了分子相互作用、信号通路、细胞功能、体内效应和人群健康风险。我们发现CDP和TPHP在机制–效应–风险方面的效力存在显著差异，CDP表现出更强的PPARγ干扰效应。进一步的研究是有必要的，因为目前还没有直接的流行病学证据将CDP和TPHP与肥胖联系起来。未来的人群研究应适当关注CDP/TPHP与肥胖之间的关联。

作者介绍

第一作者：孙兰超，青岛大学公共卫生学院，硕士研究生，研究方向为有机磷酸脂类化合物成脂毒性和风险评估的研究，以第一作者/共同第一作者在Environmental Science & Technology、Science of the Total
Environment、Journal of visualized experiments发表论文3篇。