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通讯作者：张涵，柴宏祥
通讯单位：西南交通大学，重庆大学
https:///10.1016/j.watres.2024.122572
· 在超低溶解氧条件下（0.05 mg/L）实现全自养脱氮。
· 阐明全程氨氧化细菌（Comammox）在不同溶解氧条件下的丰度及功能。
· 讨论和分析了不同溶解氧条件下富集菌群的脱氮效能及途径。
· OLAND中异养反硝化、硝酸盐异化还原为氨和厌氧氨氧化途径共存。
硝化过程是氮循环的重要组成部分，通常由氨氧化细菌（AOB）和亚硝酸盐氧化菌（NOB）分别催化完成，而Comammox则能够同时催化两步反应。限氧自养硝化-反硝化（OLAND）是一种经济节能的脱氮过程，相较于传统脱氮过程需要的氧气量减少63%，有机碳源减少100%。该过程由AOB和厌氧氨氧化细菌（anammox）协作完成。而现有研究发现，Comammox在氧气或氨氮浓度受限的环境中占主导地位，且可以与Anammox协同脱氮，但其在OLAND过程中的作用尚未探明。本研究旨在揭示Comammox在OLAND过程中的长期作用。研究以氨氮作为唯一氮源，在四种溶解氧条件下进行实验，包括：好氧（HD，2 mg-O2/L）、低氧（LD，0.5 mg-O2/L）、限氧（ULD1，0.1 mg-O2/L）和超低氧（ULD2，0.05 mg-O2/L），探究其脱氮能力、速率及动力学模型。结合16S rRNA基因全长测序和宏基因组学分析，研究脱氮途径和Comammox的丰度及功能。研究结果表明，在OLAND过程中，Comammox而非AOB是主要的硝化菌，与Anammox、异养反硝化和AOB共存。
图1 图文摘要
长期脱氮效果（图2）表明，当反应器稳定后，ULD2中的残余氨氮浓度与HD和LD相当，说明即使在超低溶解氧条件下，富集的硝化细菌也能有效发挥脱氮效能。在所有阶段，亚硝酸盐浓度都保持在0.8 mg-N/L以下，这表明即使在超低溶解氧条件下，亚硝酸盐也不会积累。此外，与HD和LD相比，ULD1和ULD2的硝酸盐和TN浓度明显更低，TN去除效率分别从37.4%和26.1%提高到71.5%和71.7%，说明OLAND在限氧条件下也可以实现高效脱氮。
图2 不同溶解氧条件下的脱氮效能。（a）、（b）、（c）和（d）分别代表 HD、LD、ULD1和ULD2
不同溶解氧条件下富集菌群的脱氮效能如图3所示。在超低溶解氧条件下富集的微生物在氨氮浓度为30和40 mg/L时，好氧氨氮去除率更高，与Comammox Nitrospira inopinata的去除率相当。低氨氮浓度和高氨氮浓度的最佳拟合模型分别是一阶动力学模型和二阶动力学模型，这表明存在不同的氨转化途径。在氨氮浓度较低时，氨氮去除率降低，可能是由于硝酸盐异化还原为氨（DNRA）的作用，因为DNRA通常存在于硝酸盐浓度较低的环境。
图3 不同溶解氧环境条件下不同氨氮负荷时的硝化速率和动力学参数。（a）氨氮负荷为5、10、20、30和40 mg/L时的氨氮去除率。（b）氨氮去除拟合动力学模型的速率常数。（c）单位重量蛋白质的TN去除率。（d）拟合氮氧化物产生的动力学模型的速率常数。红色星号表示在相同氧气浓度条件下使用富集的微生物进行不同氨负荷的批次实验结果之间存在显著差异（p<0.05）。黑色星号表示在相同负荷条件下，不同溶解氧环境条件下富集的微生物进行的分批实验结果之间存在显著差异（p<0.05）。
2 超低溶解氧条件下Comammox的丰度显著高于AOB
全长16SrRNA测序（图4）和宏基因组分析结果（图5）表明，Comammox的丰度显著增加，占微生物群落总量的34%，而AOB的丰度仅为2.1%。尽管之前的研究认为，OLAND过程中主导短程硝化的细菌是AOB，但本研究结果表明，氧限制条件下OLAND过程中Comammox丰度显著高于AOB。
图4 基于16S rRNA全长测序的微生物群落组成和功能模块分析。（a）物种水平的微生物丰度。（b）前100个丰度最高的物种中与脱氮相关的微生物。（c）系统发育树。（d）原核生物类群功能注释（FAPROTAX）预测的功能热图。
Binning结果显示，Comammox拥有与细胞色素bd氧化酶、甲酰胺酶和甲酸脱氢酶相关的基因。细胞色素bd氧化酶对氧气的亲和力高，在限氧条件下具有重要作用，而甲酰胺和甲酸分解有关的基因，可为同化作用提供能量。由于甲酸和甲酰胺是厌氧发酵微生物的主要产物，这些基因使其具有在限氧环境中利用其他底物进行生长代谢的能力。
图5 amo、hao和hzs的基因组基因位点以及参与氨氧化和厌氧氨氧化作用的bins的编码基因。*代表完整度超过90%的bin。
脱氮功能相关基因在不同溶解氧条件下的丰度如图6所示。细胞间质亚硝酸盐氧化还原酶（nap）基因在ULD1和ULD2的硝酸盐富集且碳源限制环境中高度表达，与高通量结果预测的不断增加的反硝化模块一致。使用NADH作为电子供体的nap进行反硝化时，能量损失仅为8%，这表明细菌在无有机碳源供给条件下选择了能量损失较少的反硝化方式。此外，在限氧条件下，DNRA模块丰度明显增加，而Nrf和nir基因在ULD2和ULD中含量也较HD和LD更高，表明异养反硝化和DNRA在OLAND过程中发挥着重要作用。
图6 脱氮酶基因拷贝变化趋势。*：通过差异基因分析（DGA）的标记酶的丰度
在以碳酸盐为唯一碳源的超低溶解氧条件下，OLAND工艺的氨氮和TN去除率分别达到99.6%和71.7%。
动力学模型分析结果表明OLAND过程中存在多种氨氮去除途径。
Comammox而非AOB是OLAND过程中的主要硝化细菌。
OLAND过程中存在异养反硝化、DNRA和anammox途径。
向钰，博士，西南交通大学讲师。主要从事城市面源污染治理及水生态修复相关研究工作，重点关注以全程硝化细菌（comammox）为代表的脱氮途径。近三年主持国家自然科学基金项目1项、省部级项目1项、地厅级项目1项；在Water Research、Bioresource Technology、Water Research X等期刊发表SCI论文十余篇；授权发明专利2项。
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