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Targeting Stem Cells and Dysplastic Features With Dual MEK/ERK and STAT3 Suppression in Gastric Carcinogenesis
今天给大家带来2023年10月由范德比尔特大学的Eunyoung Choi发表在Gastroenterology的一篇文章“Targeting Stem Cells and Dysplastic Features With Dual MEK/ERK and STAT3 Suppression in Gastric Carcinogenesis”。胃化生和不典型增生会导致患胃癌的风险增加，胃癌是一种治疗选择有限的致命疾病。然而，目前缺乏专门针对这些癌前病变的有效策略。为了解决这个问题，通过构建化生和不典型增生胃类器官模型、确定在化生过程中上调的关键信号通路，以及在不典型增生过程中对干细胞生存和功能至关重要的关键信号通路。
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研究人员使用化生（Meta3）和发育不良（Meta4）的胃类器官来评估吡维铵和曲美替尼的药物作用。结果显示，与对照组相比，Meta3在吡维铵、曲美替尼以及两者的治疗下显示出生长抑制。Meta4在曲美替尼治疗下，仅一个系表现出生长抑制，其他系表现出类器官较薄，密度较低；Meta3在吡维铵治疗后，不仅导致类器官大小减小，而且导致广泛的细胞死亡。然而，吡维铵和曲美替尼的联合治疗并未对Meta4类器官产生任何相加或协同作用。综上所述，这些结果表明吡维铵可以诱导发育不良类器官的细胞死亡并抑制化生类器官的生长。
2 吡维铵影响小鼠化生和发育不良胃类器官中的ERK和STAT通路
为了确定Meta4类器官中吡维铵控制哪些信号通路，使用经吡维铵处理的Meta3和Meta4类器官进行了磷酸化蛋白组学分析，吡维铵治疗最显著的效果是STAT通路相关蛋白的去磷酸化。
为了识别吡维铵诱导Meta4类器官细胞死亡的潜在蛋白，研究人员假设Meta4类器官中上调的候选蛋白在吡维铵处理后会表现出显著磷酸化的降低，选择了前10个候选蛋白分析，由于胃类器官源自Mist1-Kras双抗小鼠，因此排除与MAPK和PKC相关的蛋白质，结果表明STAT3信号在发育不良细胞中上调，并且可能是发育不良细胞存活的重要途径。
3 吡维铵通过双重阻断ERK和STAT3信号通路诱导发育不良胃类器官细胞死亡
STAT3激活通常是由pSTAT3Y705或p-STAT3S727的磷酸化诱导的。磷酸化蛋白组学和免疫印迹分析证实，胃类器官在吡维铵处理后显示STAT3Y705和ERK的磷酸化降低。这些发现表明，STAT3Y705和ERK磷酸化的双重抑制对于诱导发育不良胃类器官的细胞死亡是必要的。STAT3Y705在Meta3胃类器官中的磷酸化水平明显低于Meta4胃类器官，并且类器官没有表现出任何细胞死亡。
研究人员使用3种不同的STAT3特异性抑制剂（STAT3-IN-1、Static和CPT）处理Meta3和Meta4胃类器官，所有的STAT3特异性抑制剂对Meta3胃类器官的存活和生长无影响，表明吡维铵仅通过抑制Meta3胃类器官中MEK/ERK的信号传导来诱导生长停滞；STAT3-IN-1和Static诱导Meta4胃类器官生长停滞，但不会导致死亡，然而曲美替尼和 STAT3-IN-1的共同治疗导致Meta4胃类器官细胞死亡；使用SSTC3（CK1α激活剂）不会降低p-STAT3Y705或p-ERK的表达，证实吡维铵的作用不是通过CK1α激活；吡维铵处理后，几个STAT3靶基因的表达下调。综上表明，ERK和STAT3信号通路的双重抑制对发育不良类器官的存活至关重要。
4 吡维铵靶向Trop2+CD133+CD166+ DSCs
为了评估受吡维铵处理影响的发育不良胃类器官的转录组水平，使用来自Meta4胃类器官的细胞进行了单细胞RNA测序，UMAP分析证明使用吡维铵引起类器官转录水平发生巨大变化。火山图和UMAP分析表明，在DMSO处理的细胞中观察到的几个STAT3靶基因，如Fos、Fosb和Jun在吡维铵处理后下调，而损伤相关基因，如Dusp4、Ddit3和Areg在吡维铵处理后上调。此外，研究人员发现吡维铵处理的细胞中7-AAD和膜联蛋白V表达均显著增加，证实了吡维铵响应坏死和细胞凋亡的活性增加。
值得注意的是，吡维铵处理后未观察到DSC亚群，qRT-PCR验证了CD133和CD166基因表达的减少，FACS分析也证明CD133+CD166+ DSCs显著减少。这些发现表明，吡维铵特异性靶向DSCs和增殖细胞，导致发育不良的类器官细胞死亡。
5 使用吡维铵可抑制小鼠胃化生至不典型增生的过程
接下来，进一步研究在体内化生进展到不典型增生过程，STAT3信号通路是否上调。对胃出现化生腺体的Mist1-Kras小鼠，再使用DMSO或吡维铵1周或2周，检查每组小鼠的胃粘膜，在用吡维铵治疗的小鼠中，分泌酸的壁细胞逐渐重新填充到粘膜体中，增生性中心凹腺体的数量显著减少，发育异常腺体的数量也显著减少，吡维铵治疗导致pSTAT3和Pim-1下调。
进一步探讨吡维铵治疗后免疫微环境的变化，吡维铵治疗导致CD4+ T细胞群急剧减少，但 CD8+ T或CD19+B细胞没有显著差异，M2型巨噬细胞已被证明可以促进SPEM和IM的进展，吡维铵处理后，小鼠体内自然杀伤细胞和CD163阳性M2型巨噬细胞数量显著减少。这些结果表明，吡维铵有效抑制胃部化生进展为不典型增生，并通过提供抗炎微环境促进体内正常胃粘膜的再生。
6 吡维铵抑制异常增殖的人癌前胃类器官的生长和存活
从手术标本获得20个人癌前胃类器官（human precancerous organoid，hPCO）库，根据化生细胞标记物的AQP5和CD44v9以及发育异常细胞标记物的TROP2的形态和表达谱来表征hPCO系，使用曲美替尼、吡维铵及其组合对hPCO进行药敏实验，测量类器官的直径并检查类器官死亡情况。结果显示，5个敏吡维铵的hPCO系显示出显著的类器官死亡；而9个抗吡维铵的hPCO系大部分仍存活，没有或有少量死亡细胞；6个中抗吡维铵的hPCO系表现出轻度至中度的细胞死亡。另外观察到，敏吡维铵的hPCO系对曲美替尼没有反应，与之前观察到的小鼠类器官生长抑制相反，抗吡维铵的hPCO系（hPCO-12、hPCO-19和hPCO31）没有死亡，但在吡维铵和/或曲美替尼处理后仍表现出生长停滞。热图显示，敏吡维铵的hPCO系，TROP2的表达呈正相关，AQP5和CD44v9的表达呈负相关。综上所述，吡维铵与hPCO系的发育不良特征显著相关。
7 吡维铵阻断人发育不良的hPCO系中ERK和STAT3信号通路
进一步研究hPCO系中吡维铵与STAT3和ERK信号通路激活之间的关系，检测hPCO经吡维铵处理后STAT3Y705和ERK磷酸化水平的变化，吡维铵处理后，3个敏吡维铵hPCO系中的pSTAT3Y705和p-ERK水平下降，而在抗吡维铵组中没有观察到显著差异。后续，使用3种STAT3特异性抑制剂处理hPCO系，Static或CPT抑制了敏吡维铵hPCO-2类器官的生长，但类器官仍存活至治疗后6天，抗吡维铵的hPCO-31并未对STAT3抑制剂产生反应。综上所述，吡维铵可以通过同时抑制STAT3和ERK信号通路来有效抑制hPCO的生长和存活。
本研究利用小鼠和人类癌前胃类器官，确定了化生和发育不良阶段信号通路的变化，吡维铵通过双重阻断MEK/ERK和STAT3信号通路，可以有效诱导化生中的生长停滞和不典型增生胃类器官的细胞死亡。因此，吡维铵是一种有前途的化疗药物，可重编癌前环境以预防胃癌的发展。
Kim H, Jang B, Zhang C, et al. Targeting Stem Cells and Dysplastic Features With Dual MEK/ERK and STAT3 Suppression in Gastric Carcinogenesis. Gastroenterology. 2024;166(1):117-131. doi:10.1053/j.gastro.2023.09.040
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