转自：ZJU环境微生物课题组
responses during preservation
保藏过程中厌氧氨氧化颗粒污泥的响应及演变机制
期刊：Water Research
影响因子（5年）：12.2
DOI：doi.org/10.1016/j.watres.2024.122447
文章摘要
厌氧氨氧化颗粒污泥（AnGS）的贮备是拓展厌氧氨氧化工艺应用的重要推手。氧气是厌氧氨氧化研究中常见且十分重要的影响因素，已有许多研究关注了氧气对其工艺性能及厌氧氨氧化菌（AnAOB）的影响，然而在长期保藏过程中氧气对AnGS的影响仍不清楚。因此，本研究模拟了敞口和密闭两种保藏条件，研究了氧气对保藏过程中AnGS的影响，并探讨了其作用机制。结果表明，敞口保藏系统处于氧化状态，其内溶解氧（DO）浓度的平均值为(3.10±1.36) mg/L，氧化还原电位（ORP）均值为(112.58±46.78) mV；密闭保藏系统则处于还原状态，DO浓度低于检测下线，ORP均值为(-153.96±64.32) mV。随保藏时间延长，两个系统中AnGS的活性均不断下降，但AnGS在形态结构、细菌群落、细菌存活率和细菌抗氧化能力等方面均表现出不同的响应和演变。在敞口系统中，活性氧产生并破坏了功能菌细胞膜中的不饱和脂肪酸，导致细胞结构破坏，进而造成污泥活性下降；在密闭系统中，AnAOB在长期保藏后逐渐进入休眠状态，有利于AnGS及AnAOB保持较好的形态结构、保存较高的活细胞比例和AnAOB丰度。本研究结果将有望为工程化AnGS保藏系统的设计和优化提供支撑。
摘要图
主要内容
1.保藏系统的氧化还原水平
密闭系统经过曝气除氧后，溶解氧低于检测下限，ORP均值为(-153.96±64.32) mV，系统处于还原状态。而敞口系统与空气连通，DO平均浓度为(3.10±1.36) mg/L，ORP均值为(112.58±46.78) mV，系统处于氧化状态，偏离了AnGS原本的还原态生境。
2.保藏过程中厌氧氨氧化颗粒污泥的活性
活性是菌种质量的核心指标，也是评价AnGS保藏质量的主要参数。AnGS的活性通过宏观层面的污泥比活性和微观层面的AnAOB基因表达水平进行表征。两者的变化趋势类似，密闭系统呈现“下降-稳定-下降”的变化特征，而敞口系统则呈现“下降-波动-下降”的变化特征。由此可见，以活性为指标，两个保藏系统的适宜保藏期为1.5个月；在此期间，敞口系统的保藏效果优于密闭系统。
图2. 保藏过程中两系统内的AnGS的比活性(a)和AnAOB的16S rRNA基因表达水平(b)
形态结构是污泥功能的外在表现和内在支撑。如图3(A)所示，始态新鲜的AnGS颜色鲜红，表面紧致；EPS丰富，细胞聚群，AnAOB细胞完整，细胞壁、细胞膜以及胞内区室结构可见清晰，厌氧氨氧化体饱满。保藏后颗粒污泥的形态结构均发生明显变化。在敞口条件下，AnGS多数变为黑色，颗粒碎片化、结构絮化；EPS明显稀疏，出现大量空腔，AnAOB数量显著减少，细胞变形解体，厌氧氨氧化体游离于胞外，变化更为显著。
细菌群落是AnGS发挥Anammox功能的基石。保藏后，两系统内的群落组成结构均发生明显变化，浮霉菌门和AnAOB的占比均随保藏时间下降，丧失优势地位。保藏第66天，敞口系统中浮霉菌门仅占1.91%，AnAOB仅占1.13%，降幅均大于密闭系统。AnAOB的两个属Ca. Kuenenia和Ca. Brocadia变化有所不同。初期，Ca. Kuenenia迅速减少，由Ca. Brocadia所取代其生态位；后期，Ca. Kuenenia趋于稳定，而Ca. Brocadia则大幅下降。分析发现，这是由于Ca. Kuenenia的耐氧性和耐饥饿性均低于Ca. Brocadia所致。
活细胞AnGS展现活性的根本。保藏意味着饥饿，两系统内的活细胞占比均随时间减少；而AnAOB数量则呈现“下降-稳定-下降”的变化趋势，存在一定的滞后性。由此来看，适宜保藏期仍为1.5个月；在此期间，两系统的功能菌保留率相当。
图3. 保藏前后两系统内AnGS的形态结构(A)、细菌群落组成(B)和活细胞比例及AnAOB的16S rRNA基因丰度(C)
AnAOB虽然氧敏感性高，但具有抵御氧气的潜力。SOD活性和sod基因表达水平结果显示，两者呈现出类似的变化，初期快速上升后逐渐下降，在整个保藏过程中敞口系统的抗氧化水平始终高于密闭系统，表现出强烈的抗氧活性。
由于保藏期间无基质供应，功能菌没有补给来持续抵御氧气，抗氧化能力逐渐下降，那么产生的活性氧就会攻击胞内大分子物质。系统中的脂质过氧化产物丙二醛的含量随时间不断增多，敞口系统中丙二醛的生成率始终高于密闭系统且两者之间的差距不断增大。综上，敞口系统中由于SOD等抗氧化酶活性下降，导致细菌细胞膜的受损愈发严重。
完整的细胞膜是细胞生理代谢的基础。磷脂双分子层是细胞膜的基本骨架，其内部非极性域对氧的溶解度要比表面极性域高7~8倍。细胞膜也是细菌电子传递链的寓所，是氧气转化成活性氧的部位。细胞膜内的不饱和脂肪酸是维持其生理功能的重要组成，据文献报道AnAOB膜脂内的不饱和脂肪酸占比高达20%。不饱和脂肪酸因含有不饱和双键极易发生过氧化反应，细胞膜内不饱和脂肪酸极易成为氧毒的靶位。综合DO、ROS、SOD、活细胞比例、MDA含量等结果，说明敞口系统中确实存在氧毒并攻击不饱和脂肪酸，引发细胞膜受损、细胞失活。
理论上敞口保藏系统的AnGS遭受饥饿、氧毒等胁迫，活性应被抑制，但却显现出高于密闭系统的活性。分析发现，SOD活性与SAA呈正相关，表明在一定范围内氧化胁迫可刺激活性。据报道，ROS可作为信号分子参与细胞代谢的调节，敞口系统中功能菌所受的氧化胁迫更严重，应激反应也更强烈，细胞进入抗氧化状态，SOD展现出高活性以减缓活性氧的损害。同时，由于Anammox是AnAOB的能量来源，抗氧化基因表达的上调也拉动了Anammox相关基因表达水平提高，致使敞口系统中的SAA高于密闭系统。
然而保藏后期，功能菌细胞冗余物质耗尽，缺乏能源物质和原料，细胞无法持续低于氧毒，导致敞口系统中AnGS活性大幅下降；而密闭系统中，功能菌进入休眠状态，保存了较好的形态结构和活菌比例。此外，进一步分析发现活细胞比例（表征细胞膜结构的完整性）与丙二醛含量（表征细胞膜组成的完整性）负相关，再次证明不饱和脂肪酸的过氧化是细胞膜受损乃至功能菌数量骤减的主要致因，进而引发污泥功能的衰减。
因此，建议短期保藏采用敞口条件可简便操作、保持较高的AnGS活性；而长期保藏采用密闭保藏条件更适合，以便AnGS保留更好的形态结构和较高的AnAOB丰度。
小结
本研究模拟了敞口和密闭两种保藏条件，研究了两个多月的保藏过程中氧气对AnGS的影响。结果表明，敞口保藏系统处于氧化状态，平均DO浓度和ORP分别为(3.10±1.36) mg/L和(112.58±46.78) mV，而密闭保藏系统中DO低于检测下线，平均ORP为(-153.96±64.32) mV，处于还原状态。经过长期保藏后，敞口和密闭两个系统的AnGS活性分别下降了97.17%和94.85%（以SAA计）、74.92%和70.10%（以基因表达水平计）。此外，在不同的保藏条件下，氧致演变引发AnGS表现出差异化的响应和变化。在敞口系统中，活性氧产生并破坏细胞膜中的不饱和脂肪酸，进一步导致细胞结构破坏和活性下降。然而，在密闭系统中，AnAOB倾向于在长期保藏后进入休眠状态，因而保留了较高的AnAOB丰度和活细胞比例。因此，建议短期保藏采用敞口条件可简便操作、保持较高的活性；而密闭保藏条件则更适合长期保藏，以保留较高的AnAOB丰度。
第一作者简介
第一作者：郭磊艳，浙江大学2024级博士生，研究方向为废水生物脱氮、厌氧氨氧化，以第一作者发表中英论文3篇。
作者：郭磊艳 审核：胡宝兰