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伪狂犬病毒（PRV）系属α-疱疹病毒亚科之水痘-带状疱疹病毒属，除猪以外，包括狗、老虎、牛及绵羊在内的多种哺乳动物亦可能感染PRV。研究指出，受感染动物普遍呈现神经系统疾病征象，如抽搐与瘫痪。自2018年起，中国境内已报告数起PRV感染案例，这揭示了PRV在特定条件下存在跨物种传播的可能性。鉴于此，从药物研发的视角出发，探索有效预防与治疗PRV的药物，以降低其传播风险，将是未来推动PRV根除进程的重要策略。
黄芩具有解毒及清除湿热之功效，并具备抗肿瘤、抗氧化及抗菌等多重药理活性，其对神经、免疫及肝脏系统具有显著的微生物感染防护作用。有文献指出，黄芩苷作为黄芩之主要活性成分，对炎症、癌症及病毒感染，诸如HIV-1及冠状病毒等，展现出潜在的治疗价值。尽管黄芩苷在治疗特定病毒感染方面的临床潜力已获得初步验证，但其针对PRV的效应尚待进一步探究。
日前，一篇题为“Proteomic analysis reveals the antiviral effects of baicalin on pseudorabies virus”的研究论文深入探讨了黄芩苷作为抗PRV药物开发的潜力，并为其潜在的分子机制提供了有价值的见解。
图1 论文首页
黄芩苷有效抑制宿主细胞中的PRV感染
为评估PK-15细胞对黄芩苷的耐受性，研究采用特定浓度的黄芩苷对细胞进行了为期48小时的处理，并采用CCK-8试验对细胞存活率进行了精确测量。结果显示，在黄芩苷浓度介于31.25至125μM的范围内，其对细胞存活率未产生显著影响（图2A）。紧接着，研究探索了黄芩苷对于PRV的抗病毒效应。数据表明，黄芩苷在感染后的13、25及37小时均显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖，且此抑制效果呈现出明显的剂量依赖性（图2B）。
此外，研究采用了PRV-GFP病毒株，并以0.1的感染复数（MOI）来验证黄芩苷对PRV的抑制作用。结果显示，与DMSO对照组相比，黄芩苷预处理在所有测试浓度下均显著降低了PRV-GFP的增殖水平（图2C）。为加强上述结论的可靠性，研究进行了蛋白质印迹分析，以检测PRV的关键毒力基因——gE蛋白的表达情况（图2D）。gE蛋白作为PRV感染的重要指标，其表达水平的降低进一步证实了黄芩苷对PRV增殖的抑制作用。
这些发现有力支持了黄芩苷能够有效抑制PRV感染的观点。
图2 黄芩苷抑制宿主细胞中的PRV感染
黄芩苷能有效抑制PRV的复制和释放
PRV进入PK-15细胞的过程涵盖了早期吸附和内化两个关键阶段。为验证黄芩苷是否对PRV的吸附过程产生抑制作用，研究首先对PK-15细胞进行了黄芩苷的预处理，持续时间为1小时。随后，在黄芩苷的持续存在下，将PRV引入细胞，感染同样持续1小时。完成感染后，细胞经过三次彻底的洗涤，并在无黄芩苷的2% DMEM培养基中，于37℃条件下培养24小时。之后，收集细胞样本，以精确评估病毒滴度。结果显示，黄芩苷并未对PRV的吸附过程产生显著影响（图3A）。
研究还探究了黄芩苷是否影响PRV的内化过程。PK-15细胞首先被PRV（MOI=0.1，1）感染1小时，随后用冷PBS洗涤三次以去除未结合的病毒。接着，细胞在37℃条件下接受黄芩苷处理1小时，随后再培养24小时。并采用TCID50测定法，通过测量病毒滴度来评估内化效果。结果显示，黄芩苷对PRV的内化同样未产生显著影响（图3B）。
在复制实验中，PK-15细胞首先在37℃条件下被PRV（MOI=0.1）感染1小时，随后与含有125μM黄芩苷的培养基共同孵育指定时间。之后，研究收集细胞样本，分别检测PRV DNA的拷贝数（图3C）和早期病毒蛋白UL54 mRNA的表达水平（图3D）。结果表明，黄芩苷能够有效抑制PRV的复制过程。
最后，为了评估黄芩苷对PRV释放过程的影响，研究再次将PK-15细胞在37℃条件下用PRV（MOI=0.1）感染1小时，随后与不同浓度的黄芩苷共同孵育。在感染后的12小时，分别收集细胞和上清液样本，以测定细胞内和细胞外的病毒滴度（图3E）。释放效率则通过TCID50比值进行量化分析。结果显示，黄芩苷对PRV的释放过程具有显著的抑制作用（图3F）。
图3 黄芩苷抑制PRV的复制和释放
黄芩苷对PRV病毒蛋白的影响
为进一步量化筛选出的可信蛋白质表达水平的变化，研究对各实验组进行了严格的统计分析，并采用了主成分分析（PCA）方法，明确揭示了PRV组与黄芩苷处理PRV组之间存在显著的表达差异（图4A）。此外，研究还精心编制了热图（图4B），以直观凸显不同样本中病毒蛋白的上调和下调趋势，从而深刻揭示了黄芩苷对PRV不同蛋白的差异化抑制效应。
值得注意的是，通过严格筛选与比对，研究共鉴别出14种受到黄芩苷显著下调的病毒蛋白。结合PRV复制周期图，研究者对这些下调蛋白进行了精准定位与标记，据此推断黄芩苷的主要作用靶点可能集中在参与PRV生命周期关键环节的病毒蛋白上，特别是与病毒吸附、进入及释放过程紧密相关的蛋白（图4C）。
图4 黄芩苷对PRV病毒蛋白的影响
KEGG和GO功能通路中关键基因和通路的验证
研究采用了流式细胞术技术，对不同组别中活性氧（ROS）的表达水平进行了定量分析（图5A）。结果显示，PRV感染显著提升了PK-15细胞内ROS的水平，而黄芩苷的加入则有效降低了这一活性氧水平。此外，为进一步探究相关机制，研究针对共享功能通路中的关键差异调节蛋白进行了表达检测。具体而言，qPCR技术测定了补体和凝血级联途径中核心基因（例如F3）的mRNA表达水平（图5B）。结果表明，黄芩苷能够显著上调F3蛋白的表达，而PRV感染则对其表达产生了抑制作用。这一发现表明黄芩苷可能通过增强PK-15细胞内的补体和凝血级联反应来抑制PRV感染。
为了对GO功能途径进行验证，研究进一步通过qPCR技术评估了线粒体及核质区域中几个关键基因的表达情况。这些基因包括线粒体中的NFU1铁硫簇组装酶（NFU1）以及核质相关的溶质载体家族3成员2（SLC3A2）和CCAAT增强子结合蛋白β（CEBPB）（图5C）。与蛋白质组学数据相吻合的是，与PRV感染组相比，黄芩苷处理后的PRV感染组中NFU1的表达水平显著降低。同时，黄芩苷还显著促进了SLC3A2和CEBPB的表达，且这种趋势在黄芩苷单独处理组中也得到了体现（与Mock组相比）。综上所述，黄芩苷可能通过抑制线粒体活性并增强核质表达来参与减少PK-15细胞中的PRV感染。
图5 验证KEGG和GO功能通路中的关键基因和通路
结论
结果表明，黄芩苷能有效抑制PRV的复制过程，进而论证其在PK-15细胞中对PRV感染的抑制作用。这一发现为黄芩苷的抗病毒特性提供了深入且有价值的见解。
Niu Q, Zhou C, Li R, Guo J, Qiao S, Chen XX, Zhang G. Proteomic analysis reveals the antiviral effects of baicalin on pseudorabies virus. Int J Biol Macromol. 2024 Oct;277(Pt 1):134149. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2024.134149
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