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第一作者：林文芳
https:///10.1021/acs.est.4c02906
· 建立了生物正交非典型氨基酸（BONCAT）荧光标记技术识别活性耐药菌。
· 应用BONCAT结合流式荧光细胞分选（FACs）鉴别和定量污水活性耐药菌。
· 利用宏基因组学技术解析了活性耐药微生物的抗性组和移动组。
· 发现了同时含抗性基因和移动元件的高风险活性宏基因组装基因组。
微生物耐药性（AMR）对全球公共卫生构成重大威胁。近几十年来，抗性基因（ARGs）和耐药细菌（ARB）几乎在所有的环境中均被检出，特别是污水处理厂已成为AMR的储存库，在耐药性的富集和传播扩散中发挥着至关重要的作用。过去关于环境AMR的研究主要采用的是不依赖于培养的分子生物学方法，如定量PCR（含高通量定量PCR）和宏基因组测序技术等，这些方法极大增强了我们对ARGs和微生物组成的了解。然而，ARGs的存在并不能完全反映微生物的表型耐药。环境中的ARGs可能源于死亡或休眠的细菌，造成健康风险的高估。反之，环境中活跃的ARB更容易发生增殖和传播，在驱动AMR行为中发挥着重要的作用，但它们仍未得到充分的关注。此外，环境中的活性ARB潜在的表型与基因型之间的联系尚不清楚。因此迫切需要研究环境中具有表型代谢活性的ARB。
图1 BONCAT标记技术识别活性耐药菌；（A）工作原理示意图；（B）荧光显微镜观察敏感菌发光情况；（C）荧光显微镜观察耐药菌发光情况
生物正交非典型氨基酸标记技术，是利用活性微生物摄入含炔基或叠氮的氨基酸，然后通过点击化学反应，将含叠氮或炔基的荧光基因链接上去，实现微生物蛋白质的高效特异性标记。该方法已被用于监测土壤、污泥、温泉等环境介质的活性微生物及研究其生态功能。基于此原理，我们假设在孵育期间添加抗生素阻碍敏感菌吸收氨基酸，而耐药菌不受影响可发出明亮的荧光，从而实现耐药菌和敏感菌的特异性分离（图1）。本研究，我们首先建立了BONCAT识别活性耐药菌的方法。选取6株不同耐药菌株，含氨苄青霉素（AmpR）、卡那霉素（KanR）、四环素（TetR）、利福平（RifR）、环丙沙星（CipR）及头孢噻肟（CefR）抗性菌；以及标准敏感质控菌株（E. coli 25922）。将菌株分别接种到M9培养基孵育时，添加0、1×MIC、及10×MIC浓度的抗生素，观察菌株的荧光强度随抗生素浓度的变化情况。结果发现，除氨苄青霉素抗性菌（AmpR）需要10×MIC的抗生素，其他菌株只需1× MIC的抗生素浓度即可将抗性菌和敏感菌显著区分（图2）。
图2 探索BONCAT标记技术区分不同种类耐药菌和敏感菌所需的抗生素浓度；（A）卡那霉素; （B）利福平; （C）四环素; （D）环丙沙星; （E）氨苄青霉素; （F）头孢噻肟
进一步，我们将建立的方法应用于实际污水活性耐药菌的鉴别。采集了进水（IF）、二沉池出水（SST）、及最终出水（EF），添加对应的抗生素进行孵育，再用流式检测活性耐药菌的种类和浓度。结果发现，在污水样品共检测到6种不同类型的活性耐药微生物，其占总细菌的比例在IF、SST、及EF样品中分别为13.5%–40.0%、1.39%–18.5%、0.28%–45.3%，表明污水处理厂是活性耐药菌的聚集地。此外，随着工艺处理流程活性耐药菌的浓度下降了3–4个数量级，但是在出水仍可以检测到4.79×104 cells/mL浓度的活性耐药菌（图3）。它们一旦释放到营养丰富的下游水体，将发生迅速增殖，带来严重的健康风险。
图3 BONCAT-FACS技术识别污水活性耐药菌；（A）环丙沙星和头孢噻肟耐药菌的流式检测图；（B）污水样品不同种类活性耐药菌的比例及浓度
接着，我们利用扩增子测序比较活性耐药菌与整体耐药菌的群落组成，发现在微生物组成上两者没有显著差异，但是一些种属如克雷伯氏菌（Klebsiella）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）及芽孢杆菌（Bacillus）在活性耐药微生物组所占的比例更高，表明该单细胞技术有助于研究环境表型活性耐药菌，将其与非活性ARB及胞外ARGs区分。进一步，通过宏基因组技术深入挖掘具有表型活性耐药菌的抗性组及移动组。结果发现，微生物的耐药表型与基因型并不完全一致，分析可能原因一是活性ARB的表型抗性依赖于表达的ARGs而非总的ARGs；二是污水环境检测到很大比例的多重耐药类ARGs。最后，我们分析表型活性ARB携带的ARGs、毒力因子（VFGs）、及遗传元件（MGEs）的共现性，发现有135个重叠群（Contigs）同时携带ARGs和VFGs，及51个重叠群同时携带ARGs和MGEs（图4）。特别是，发现3个高质量的宏基因组装基因组（MAGs），同时携带ARGs、MGEs、及VFGs，暗示它们潜在的高健康风险。
图4 宏基因组分析流式分选的活性耐药菌携带ARGs和MGEs共现性关系（9个代表性Contigs展示）
这项工作提出了一种可在复杂环境中监测和定量活性ARB的高通量单细胞技术，整合了BONCAT标记、高通量FACS和宏基因组测序，可直接监测环境中代谢活跃的ARB。该方法不仅为环境中活性AMR的监测提供了定量手段，也为环境AMR健康风险的准确评估进行补充，同时为揭示ARB的表型和基因型之间的联系提供新的见解。在未来，该技术可以很容易地扩展到不同的环境和其他抗生素耐药表型，从而推进我们对环境活性抗生素耐药组及相关健康风险的理解。
林文芳，博士，中国科学院城市环境研究所副研究员，硕士生导师。长期从事基于分子生态学技术和单细胞技术研究城市环境微生物安全的研究工作，含饮用水系统、塑料际生物膜、及食物腐败过程细菌抗生素抗性的传播扩散及维持机制等。主持国家自然科学基金青年和面上项目、福建省自然基金项目，参与国家自然科学基金国际合作项目、中国科学院战略性先导科技专项等课题。以第一作者及通讯作者在Environ Sci Technol、Water Res，Environ Int等SCI期刊发表论文10余篇，申请国家发明专利2项。
崔丽，博士，中国科学院城市环境研究所研究员，博士生导师，国家优青。长期从事环境微生物单细胞拉曼新技术研发，并研究原位复杂环境中抗生素耐药性、病原菌、以及固氮和解磷等有益功能菌。已在Nat Food，PNAS，Angew，JACS，PNAS nexus，EST，Anal Chem等发表论文70余篇，应邀在Trends Microbiol，Anal Chem和Trends in Anal Chem发表拉曼研究微生物的方法综述。担任美国微生物学会旗下杂志mSystems编辑，Chinese Chem lett、环境化学等编委。主持NSFC国家优青基金、微塑料专项项目、重大研究计划，以及中国科学院从0到1原始创新项目等10余项，参与NSFC创新群体研究项目。
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