微精选

由病原真菌引起的植物病害对全球粮食产业和水果工业造成了巨大的经济影响。施用有机肥并辅以生防微生物（即生物有机肥）已被证明能够提高植物对病原菌的抵抗能力，其中部分原因是生物有机肥影响土壤微生物群落结构和功能。然而，目前尚不清楚这些效应是由微生物菌剂的特殊作用、有机肥料中自然存在的微生物种群还是堆肥基质的物理化学性质所驱动的。本研究旨在探究生物有机肥抑制病害的生态机制。

为了弄清生物有机肥的作用机理，南京农业大学沈其荣院士团队设置了以下4种处理：有机肥（OF）、生物有机肥（含枯草芽孢杆菌W19）（OF+W19）、灭菌有机肥（SOF）、含枯草芽孢杆菌W19的灭菌有机肥（SOF+W19），调查了三个生长季节中香蕉枯萎病的发病情况及对应的土壤微生物群落结构，并进行土壤采样和DNA提取，后进行一系列鉴定分析。

1. 香蕉枯萎病发病率

图1. （A） 四种施肥处理下香蕉枯萎病的发病率。（B） 第二季根际土壤中尖孢镰刀菌的可培养丰度、总丰度和相对丰度。

在田间试验的3个生长季节中，生物有机肥处理（OF+W19和SOF+W19）都能减少香蕉枯萎病的发生。与有机肥处理（SOF和OF）相比，含枯草芽孢杆菌的OF+W19在每个季节的发病率最低（图1A）。SOF+W19组和SOF+W19组的发病率无显著性差异，而OF+W19和SOF+W19处理间的发病率无显著性差异。

从第二个生长季后土壤的扩增子测序数据中，还检测到OF+W19和SOF+W19处理的根际土壤中尖孢镰刀菌（Fusariumoxxysporum）的相对丰度比SOF和OF处理低（图1B）。这一发现得到了定量菌落计数和qPCR分析的支持（图1B）。三种方法测定的发病率与根际土壤中的尖孢镰刀菌丰度呈正相关，并且发现病害发生率与根系土壤中可培养的尖孢镰刀菌丰度呈正相关。

2. 微生物群落组成

图2. 细菌（A）和真菌（B）群落组成的非度量多维标度（NMDS）排序；（C）结构方程模型。

微生物群落组成分析显示，根际土壤和非根际土壤的细菌存在显著差异（图2A），真菌则没有差异（图2B）。总的来说，根际土壤细菌的相似性是大于非根际土壤细菌的相似性的，而真菌群落对不同施肥制度没有表现出明显的一个变化模式。结构方程模型（通径分析）（图2C）表明，解释病害的最强驱动力是病原菌密度（r=0.459，p=0.003），其受根际细菌群落组成的负影响（r=-0.360，p=0.015）。非根际土壤细菌群落结构在很大程度上决定了根际细菌群落的组成（r=0.756，p=0.005）。

3. 微生物响应类群

图3. （A）进化树显示了233个根际土壤细菌OTU之间的系统发育关系。从内到外的圆环代表1）OTU的门类分类；2）OTU对四种处理有显著反应（LDA> 2）；3）OTU的倍数变化；4）OTU相对丰度与发病率之间的相关性；5）OTU相对丰度的可变模式。（B）在不同处理中假单胞菌OTU7的相对丰度。（C）假单胞菌OTU7的相对丰度与发病率之间的线性回归关系。根系（D）和根际土壤（E）中总芽孢杆菌和假单胞菌的种群密度之间的线性回归关系。

进一步研究了哪些细菌OTUs与特定施肥处理和香蕉枯萎病的程度相关。基于线性判别分析（LDA），233株根际细菌OTUs在不同施肥条件下存在差异。与有机肥处理相比，生物有机肥处理富集了43个OTU（丰度增加了2倍以上）。Spearman相关分析发现34个OTU与疾病发生率相关（FDR<0.05）（图3A）。在这些响应的微生物类群中，假单胞菌的优势类群OTU7显示出特别显著的模式，促使对这个OTU进行更详细的检查。在生物肥料处理中，假单胞菌OTU7的相对丰度最高，分别占OF+W19和SOF+W19细菌群落总数的4.94%和3.27%（图3B）。相比之下，在OF和SOF处理中，OTU仅占细菌总数的1.00%和1.25%（图3B）。此外，假单胞菌OTU7与枯萎病发病率呈负相关（P<0.001）（图3C）。

4. 假单胞菌分离物及其对镰刀菌的抑制、生物膜形成和芽孢杆菌吸引特性

图4. （A）进化树显示88株根际土壤假单胞菌与OTU之间的系统发生关系。(B)在双重激发试验中，具有FOC抑制能力或具有W19抑制能力的假单胞菌分离物的百分比，或在与W19共培养生物膜试验中具有生物膜增强作用的假单胞菌分离物的百分比。

从经生物有机肥和有机肥改良的根际土壤微生物群中随机分离鉴定出88株假单胞菌，根据16S rRNA基因序列，代表14个不同的系统发育群（图4A）。共有36株菌株对枯萎病病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC）表现出拮抗作用，其中生物有机肥处理（OF+W19）的假单胞菌比例高于有机肥处理的菌株（t检验，P<0.01，图4B）。52%的根际土壤中的假单胞菌对溶淀粉双歧杆菌W19没有影响，而根际土壤中有74%的假单胞菌对W19有抑制作用（t检验，P<0.01，图4B）。

5. 假单胞菌PSE78菌株的抑病能力及其与枯草芽孢杆菌W19的相互作用

图5. （A）与灭菌有机肥（SOF）和化肥（CK）处理相比，接种PSE78或PSE82的灭菌有机肥处理土壤中香蕉枯萎病的发病率。（B）香蕉根际土壤芽孢杆菌和假单胞菌种群密度的线性回归分析。（C）箱线图显示了在指定预处理基质上生长的植物根系上的FOC数量。

假单胞菌PSE78对枯萎病有较强的抑制作用（图5A）。与对照组和其他处理相比，PSE78处理组的发病率较低，平均值为12%。而假单胞菌菌株PSE82与SOF处理比较，发病率无差异（图5A）。芽孢杆菌和假单胞菌数量呈正相关（P<0.001，图5B）。虽然这三种菌株单独使用时都在一定程度上降低了FOC密度，但当PSE 78和W19共同接种在试验土壤中时，FOC密度的降低幅度最大（图5C）。有趣的是，PSE82与W19的组合在抑制病原体方面的效果不如这些菌株单独使用（图5C）。

生防菌W19在根际能够直接抑制病原菌的生长（A）；引起微生物组变化，尤其是细菌，对病原菌密度产生负面影响（B）；共激活根际微生物群落中原生的有益植物相关微生物（C）；可能导致激活与特定植物有益细菌属（如假单胞菌属）形成多物种生物膜（D）；直接或间接限制真菌病原菌感染植物根部的能力（E）。

本研究证实了生物有机肥在有效抑制病害发生方面的潜在微生物生态学机制，为通过具体管理措施诱导土壤抑病能力提供了理论基础，为将来更有效地应用生防菌剂促进农业可持续发展开辟了新的机会，也为含有多功能生防菌群生物有机肥的研制，以及高效生防菌株筛选提供了借鉴意义。