文章概述

文章标题：《Cellular heterogeneity during mouse pancreatic ductal adenocarcinoma progression at single-cell resolution》

发表日期和杂志：2019年发表在JCI insight上

在线阅读链接：https:///10.1172/jci.insight.129212

研究背景

研究背景：

胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDA）是死亡率极高的恶性肿瘤，治疗选择有限，需要更深入地了解其疾病生物学。PDA的发展是一个复杂且动态的过程，涉及癌细胞和基质细胞之间的相互作用。

研究目的：

使用单细胞RNA测序技术（scRNA-Seq）在遗传工程小鼠模型（GEMMs）中研究PDA进展过程中癌细胞和基质细胞的基因表达变化。

胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDA）：

  • 是最常见的胰腺癌类型，起源于胰腺的导管细胞，这些细胞负责产生和输送消化酶。通常在胰腺头部形成，并可沿着胰腺导管扩散。
  • PDA的特点是高度侵袭性和早期转移倾向，通常在确诊时已处于晚期，治疗选择有限，预后较差。
  • 局部侵袭：肿瘤可以侵犯邻近的血管和器官，如胃、小肠和胆管。
  • 远处转移：常见转移部位包括肝脏、肺和腹膜

单细胞数据详情

研究方法：使用scRNA-seq技术对三种小鼠胰腺癌模型，分别是KIC、KPfC和KPC模型进行测序分析

数据链接是：https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=GSE125588

实验设计：

未经治疗的小鼠在不同的时间点进行处理采样：

  • 正常小鼠在60天大时；
  • 早期KIC小鼠在40天大时；
  • 晚期KIC小鼠在60天大时；
  • 晚期KPfC小鼠在60天大时；
  • KPC小鼠在6个月大时。

单细胞样品详情：总共是5个样品

GSM3577882 Normal Pancreas
GSM3577883 Early KIC
GSM3577884 Late KIC
GSM3577885 Late KPfC
GSM3577886 Late KPC

数据情况：

GSM3577882_normal_panc_barcodes.tsv.gz 11.4 Kb
GSM3577882_normal_panc_genes.tsv.gz 212.5 Kb
GSM3577882_normal_panc_matrix.mtx.gz 6.4 Mb
GSM3577883_early_KIC_barcodes.tsv.gz 14.8 Kb
GSM3577883_early_KIC_genes.tsv.gz 212.5 Kb
GSM3577883_early_KIC_matrix.mtx.gz 9.3 Mb
GSM3577884_late_KIC_barcodes.tsv.gz 4.6 Kb
GSM3577884_late_KIC_genes.tsv.gz 212.5 Kb
GSM3577884_late_KIC_matrix.mtx.gz 6.9 Mb
GSM3577885_late_KPfC_barcodes.tsv.gz 13.3 Kb
GSM3577885_late_KPfC_genes.tsv.gz 212.5 Kb
GSM3577885_late_KPfC_matrix.mtx.gz 19.7 Mb
GSM3577886_late_KPC_barcodes.tsv.gz 6.4 Kb
GSM3577886_late_KPC_genes.tsv.gz 212.5 Kb
GSM3577886_late_KPC_matrix.mtx.gz 3.2 Mb

提供的是10X格式的标准三文件，使用Read10X()函数读取，然后创建seurat对象进行后续的降维聚类分群即可

文章主要结果简介

PDA进展过程中的细胞异质性

对比分析正常小鼠胰腺；40天大的KrasLSL−G12D/+Ink4afl/flPtf1aCre/+（KIC）小鼠胰腺，称为“早期KIC”以及和60天大的KIC小鼠胰腺，称为“晚期KIC”

进行了严格的筛选、标准化和基于图的聚类，识别了正常胰腺和PDA两个阶段中不同的细胞群体。

  • 正常小鼠胰腺：测序了2354个细胞，它们被归类为腺泡细胞、胰岛和导管细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞，以及3种不同的成纤维细胞群体。

  • 早期KIC病变：在早期KIC病变中（3524个细胞测序），观察到一个扩张的导管细胞群体的出现（占细胞的9.9%），表达已知的导管标记物，如Krt18和Sox9，并显示出早期肿瘤变化。腺泡细胞群体大大减少，而巨噬细胞和成纤维细胞总数显著增加。还识别出了与正常胰腺中相同的3种成纤维细胞群体。

  • 晚期KIC病变：测序了804个细胞，正常外分泌和内分泌细胞缺失，存在2种不同的癌细胞群体，表明疾病过程中的表型异质性。只有2种不同的成纤维细胞群体，巨噬细胞成为肿瘤中的主要细胞群体。

晚期PDA中富含间充质标记的癌细胞

对上皮标记（Cdh1、Epcam、Gjb1和Cldn3）和间充质标记（Cdh2、Cd44、Axl、Vim和S100a4）的基因表达分析表明，早期KIC肿瘤细胞群体呈现上皮表达谱

晚期KIC肿瘤中的肿瘤细胞群体中识别出2种不同的癌细胞群体：1种富含上皮标记，另1种更丰富的群体富含间充质标记

单细胞RNA测序数据通过晚期KIC肿瘤的共染色免疫组化得到了证实，显示Sox9+Vim+癌细胞侵入基质，而Sox9+Vim–癌细胞出现在更有序的细胞簇中

这些数据支持了肿瘤细胞上皮可塑性可能有助于KIC肿瘤进展过程中癌细胞异质性的观点。

对早期KIC中的早期瘤细胞、晚期KIC中的上皮和间充质癌细胞群体的显著基因进行了层次聚类分析

不同驱动突变的晚期PDA GEMMs分析

在另一个PDA GEMM——KrasLSL−G12D/+Trp53fl/flPdx1Cre/+ (KPfC)中进行了单细胞RNA测序

与晚期KIC肿瘤一致，在晚期KPfC（60天大）肿瘤中表达Krt18和Sox9的两种不同的癌细胞群：

  • 一种以Gjb1、Tjb1、Ocln和Cldn3等上皮标记为特征
  • 一种以Vim、Cd44、Axl、S100a4和Fbln2等间充质标记为特征

KPfC小鼠中的上皮和间充质癌细胞群体与KIC中相应的群体共享许多常见基因，也表达了独特的基因标记

PDA进展过程中的巨噬细胞异质性

通过在早期和晚期KIC病变中对巨噬细胞进行亚群聚类，进一步表征了PDA进展过程中的巨噬细胞群

巨噬细胞异质性：早期KIC肿瘤中有3个不同的巨噬细胞群，晚期KIC肿瘤中有2个

  • 早期KIC肿瘤中的巨噬细胞群体1以Fn1、Lyz1、Lyz2、Ear1、Ear2以及Cd14的表达为特征，并且特别表达高水平的IL-1受体配体：Il1a、Il1b和Il1rn。
  • 巨噬细胞群体2被注意到表达大量的趋化因子，包括Ccl2、Ccl4、Ccl7、Ccl8和Ccl12，以及许多与补体相关的基因
  • 第三个巨噬细胞群体表达Ccl17和Ccr7，并且富集在核糖体小单位生物合成、翻译和抗原处理功能

  • 晚期KIC肿瘤中的巨噬细胞群体1：表达S100a8和Saa3，与炎症反应有关。
  • 晚期KIC肿瘤中的巨噬细胞群体2：富含MHC-II抗原呈递分子，参与抗原呈递和适应性免疫反应。

PDA进展过程中的成纤维细胞异质性

在正常胰腺和早期KIC病变中，鉴定出3种不同的成纤维细胞群体，而在晚期KIC中只观察到2种成纤维细胞群体

为了确定这些成纤维细胞群体之间的关系以及它们在PDA进展过程中表型变化的动态，将3次分析中的成纤维细胞投影到统一tSNE图上

每个成纤维细胞群体都有其特定的标记基因，如FB1的Cxcl14、Ptn和Igf1，FB2的Nov和Pi16，FB3的Lrrn4、Gpm6a和Cav1。

  • 在PDA进展过程中，FB1和FB3成纤维细胞亚型是持续存在的，并且存在于不同的晚期PDA GEMMs中。
  • FB2群体在早期KIC病变中开始表现出类似FB1的表达谱，提示它们可能在侵袭性病变的晚期融合成具有FB1特征的单一CAF群体。

  • FB1与炎症反应相关，其炎症特征在PDA进展过程中增加；FB3包含肌成纤维细胞群体，并显示出MHC-II基因的富集。
  • 在晚期KIC中，原本专属于FB3的基因如Cdh11也在FB1和FB3中表达，这些基因可能成为晚期PDA中的全球成纤维细胞标记物。

文章小结

  1. 研究发现正常小鼠胰腺和PDA早期及晚期的细胞异质性，癌细胞在PDA进展过程中表现出上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）。
  2. 在PDA进展过程中，巨噬细胞群体增加，表现出更多的炎症特征。
  3. 正常小鼠胰腺中存在3种不同的成纤维细胞（fibroblasts）亚型，在PDA晚期演变为2种不同的成纤维细胞群体。癌细胞和成纤维细胞可能通过表观遗传机制动态调控。